Materialen en Methoden
Duplex DNA Voorbereiding. Om de 30-bp duplex DNA-moleculen te maken, werden twee oligonucleotiden met de volgende volgorde en modificaties gehybridiseerd (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Het oligonucleotide 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ werd gemerkt met Cy5 aan het 5′-uiteinde en met Cy3 aan het 3′-uiteinde. De complementaire oligonucleotide werd gelabeld met biotine aan beide uiteinden.
Eiwit Expressie en Zuivering. De gele fluorescerende proteïne (YFP) gen in de p2Bac / PFastBac-YFP-M5-CaM plasmide (een geschenk van H. Lee Sweeney, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia) werd verwijderd door PCR. De resulterende p2Bac / PFastBac-M5-CaM plasmide codeert voor kip myosine V dat is afgekapt bij Glu-1099. Een leucine-rits volgt de spoel om dimeren mogelijk te maken. Om de zuivering te vergemakkelijken, werd het myosine V eiwit N-terminaal getagd met een FLAG-tag (DYKDDDDK). Twee recombinant baculovirussen werden gegenereerd voor eiwitexpressie in Sf9 cellen. Het ene codeerde het afgeknotte myosine V en het Drosophila melanogaster calmoduline afgeleid van het p2Bac/pFastBac-M5-CaM plasmide. Het tweede virus codeerde de menselijke essentiële lichte keten, afgeleid van het p2Bac/pFastBac-ELC-plasmide. Beide virussen werden gebruikt voor co-infectie van Sf9-cellen. Het eiwit werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven door Sweeney et al. (20).
Calmodulin Labeling and Exchange. Calmoduline werd uitgedrukt en gelabeld met Cy3 of Cy5 als volgt: Een enkele cysteïne werd ingebracht in zee-egel calmoduline door middel van de mutatie Q143C. Dit calmoduline werd uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd zoals beschreven in ref. 21. Het calmoduline werd gelabeld met Cy3-maleïmide of Cy5-maleïmide (Amersham Biosciences) stockoplossingen (in DMSO) bij een 1,4-voudige molaire verhouding gedurende 20 min. Overtollige kleurstof werd verwijderd door gelfiltratie in uitwisselingsbuffer (hieronder), gevolgd door nachtelijke hydrofobe absorptie op BioBeads (Bio-Rad). De labelopname bedroeg 102% voor Cy3-calmoduline en 75% voor Cy5-calmoduline. Aliquots werden bewaard bij -80 ° C.
De uitwisseling van gelabelde calmoduline op myosine V werd uitgevoerd zoals beschreven, maar met enkele wijzigingen (22). Myosine V (150 nM) werd geïncubeerd met 0,7 nM Cy3 gelabeld calmoduline en 0,8 nM Cy5 gelabeld calmoduline in uitwisseling buffer (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) bij 22 ° C gedurende 2 minuten. Voor de uitwisseling calmodulines, 0,9 mM CaCl2 werd toegevoegd en het mengsel werd geïncubeerd bij 22 ° C gedurende 5 min. De reactie werd gedoofd met 7 mM EGTA. Het reactiemengsel werd aangebracht op een 100K MWCO Nanocep ultrafiltratie-apparaat (Pall) en driemaal gewassen met gelijke volumes van AB (hieronder) om myosine V te zuiveren van overtollige calmodulin.
Flow Cell Voorbereiding. De flow cel werd gebouwd met een glazen microscoopglaasje en zeer brekend dekglaasjes gemaakt van NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) bij elkaar gehouden door stukjes dubbelzijdig Scotch tape.
Voor de myosine V experimenten werd 15 ul biotine-BSA (1 mg-ml-1) geïncubeerd in de doorstroomcel gedurende 2 min, waarna 30 ul AB-buffer (25 mM KCl/25 mM imidazool HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) werd door de doorstroomcel om het uit te spoelen. Vijftien microliter 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) werd toegevoegd aan de cel en mocht gedurende 2 min. incuberen, waarna nog een wasbeurt werd uitgevoerd met AB buffer. De flow cel werd geïncubeerd met 15 ul van gebiotinyleerde phalloidine actine filamenten (250 nM) gedurende 5 min, gevolgd door een 100 ul wassen met AB buffer. Ten slotte werd de cel geladen met 20 ul van imaging buffer met inbegrip van calmoduline-veranderde myosine V, 5 uM calmoduline, 300 nM ATP, een ATP regeneratie systeem (0,1 mg-ml-1 creatinefosfokinase / 1 mM creatinefosfaat), en 0,5% (vol / vol) Triton-X 100 tot niet-specifieke binding te verminderen. De cel werd verzegeld met vacuüm vet en onmiddellijk afgebeeld. De uiteindelijke motor concentratie resulteerde in schaars versierde actine en dus kon een analyse van enkele myosine V moleculen.
Voor de DNA-experimenten, de biotine-BSA en NeutrAvidin werden geladen op dezelfde manier als voor de myosine V experimenten, maar de wasbeurten werden gedaan met T50 buffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Zodra de doorstroomcel had een NeutrAvidin coating, 15 ul dsDNA (30 nM) in T50 buffer met 1 mg mg-ml-1 BSA werden gestroomd en geïncubeerd gedurende 2 min, waarna 100 ul van imaging buffer werd gestroomd in. De flow cel werd vervolgens afgesloten met vacuüm vet en onmiddellijk belicht. De resulterende decoratie van DNA-moleculen op het oppervlak was voldoende spaarzaam dat fluorescerende vlekken van verschillende moleculen zelden overlap.
Microscoop Setup. De totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop werd opgezet zoals beschreven in ref. 8, met enkele wijzigingen (Fig. 5, die is gepubliceerd als ondersteunende informatie op de PNAS website). Excitatie bron stralen op 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) en 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) werden gecombineerd door een dichroïsche spiegel en uitgebreid tot een 7-mm diameter. Deze bronnen werden gericht (brandpuntsafstand = 500 mm) op de rug brandpuntsvlak van een Olympus 1,65 NA × 100 TIRF objectief door middel van een laser lijn dichroic op een lineaire DeepL vertaling die microscoop werking in zowel epifluorescentie of TIRF modi mogelijk maakt. Het objectief werd gepositioneerd onder een closed-loop, twee assen, piëzo nanoDeepL vertaling uitgerust met capacitieve sensoren voor positiemeting (Physik Instrumente, Auburn, MA). Het gereflecteerde licht uit de achterste opening van het objectief werd gericht op een kwadrant fotodiode om een signaal voor een focus feedback loop die de afstand tussen het objectief en monster geklemd met een elektrostrictieve actuator (Newport, Fountain Valley, CA) te bieden. Fluorescentie-emissie werd verzameld door het objectief, doorgegeven door twee StopLine dunne film inkepingsfilters (Semrock, Rochester, NY), een voor elke excitatiebron, en doorgegeven door een dual-view apparaat dat gelijktijdige beeldvorming van de Cy3 en Cy5 kanalen op een enkele iXon DV 887 EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, Ierland) mogelijk gemaakt. Alle gegevens werden belicht met een 0,5-seconde integratietijd. Overspraak tussen de twee kanalen (10%) vermoedelijk vertekent de afstand metingen in de richting van kleinere waarden. Onze experimentele fout, echter, maakt het niet detecteerbaar, zoals blijkt uit Monte Carlo simulaties waarin 100 paren van gemodelleerde beelden van enkele fluoroforen gescheiden door 10 nm werden gemaakt en geanalyseerd identiek als met de DNA-gegevens (hieronder beschreven). Gesimuleerde beelden van fluorescente point spread functions werden berekend door het genereren van een geïntegreerde 2D Gaussiaanse intensiteitsverdeling met een constante achtergrond waaraan shotruis werd toegevoegd. De gesimuleerde pieken hadden dezelfde afmetingen en signaal-ruisverhouding als de echte pieken. Gesimuleerde gegevens met 10% overspraak en gesimuleerde gegevens zonder overspraak zijn niet te onderscheiden door een Kolmogorov-Smirnov test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Analyse van de gegevens. Een registratie in kaart brengen van de Cy3 en Cy5 kanalen werd uitgevoerd met fiducials bestaande uit 100-nm TransFluoSphere kralen (Molecular Probes). Deze werden bij 532 nm geëxciteerd en zenden met een breed emissiespectrum uit. De korrel was in beide kanalen detecteerbaar. We plaatsten een enkele korrel op het dekglaasje, en met onze piëzotrap stapten we de korrel met nanometerprecisie in een rasterpatroon (met een tussenruimte van 0,5 µm), waarbij we bij elke stop een beeld namen. Het eindresultaat was een stapel van 312 beelden die de kraal toont in beide kanalen op verschillende posities (Fig. 1a ).
De DNA-gegevens werden geanalyseerd door zelfgemaakte software met behulp van matlab (Mathworks, Natick, MA). De routine lokaliseert automatisch pieken in het beeld door de pixels van hoge intensiteit te bepalen en ervoor te zorgen dat de omliggende pixels intensiteiten hebben zoals verwacht voor een enkele fluorofoor. Voor het aanbrengen van de pieken aan een 2D Gaussian functie om het centrum locaties te krijgen, zoeken we naar paren van pieken. De in het Cy5-kanaal gevonden pixels worden in kaart gebracht op het Cy3-kanaal, en er wordt gezocht naar pieken in de omringende Cy3-pixels. Als een piek wordt gevonden, dan is de Cy5 piek en de Cy3 piek worden beschouwd als een paar voor verdere analyse. Elke piek is fit met een 2D-Gausse functie in zijn respectieve ruimte zoals beschreven voor de kralen hierboven (Eq. 1 ). De fout op de fit-gemiddelde plaats wordt berekend met het aantal verzamelde fotonen (Nγ), 
De plaats van Cy5 wordt in kaart gebracht op het Cy3-kanaal, en de afstand tussen beide wordt berekend. Na de computationele analyse van de DNA-gegevens werden de geïdentificeerde fluorofoorparen handmatig gescreend om ervoor te zorgen dat de paren niet in de buurt van andere fluoroforen waren die zouden hebben gestoord in de analyse van de paren.
De myosine V-gegevens werden geanalyseerd door eerst een bewegende motor op het oog te identificeren. Zelfgemaakte software geschreven in matlab dan fit het begin paar fluorescerende pieken om 2D Gaussian functies zoals hierboven beschreven en bleef de pieken te volgen voor zo lang als de gebruiker opgegeven. Motoren waarvan de geconjugeerde kleurstoffen elk fotobleken in een enkele stap werden geanalyseerd, zoals het geval was voor de meeste van de motoren waargenomen, die ervoor gezorgd dat we inderdaad waren het bestuderen van motoren met slechts een Cy3 label en een Cy5 label. De resulterende trajecten werden geregistreerd door het in kaart brengen van het Cy5 traject op het Cy3 kanaal. Een kleinste kwadraten lineaire fit op de punten van beide trajecten gaf de oriëntatie van de actine filament waarop de trajecten werden geprojecteerd. Afstanden langs de lineaire fit (de actine filament) werden uitgezet tegen de tijd om de relatieve afstanden van de hoofden te zien (Fig. 4).
Tijd spoor van een differentieel gelabeld myosine V molecuul lopen langs een actine filament. De labels (Cy3 en Cy5) zijn covalent gehecht aan calmodulines die werden uitgewisseld op de myosine V molecuul. In dit spoor, zowel van de fluorescerende sonde de locaties zijn het nemen van 72-nm stappen, wat aangeeft dat de calmodulines werden uitgewisseld dicht bij de motor domein. De wisselende posities van de sondes zorgen voor een directe observatie van myosine V’s hand-over-hand loopmechanisme.