Translacja jest procesem, który obejmuje syntezę łańcucha aminokwasów z wzoru mRNA. Te łańcuchy polipeptydowe składają się w funkcjonalne białka. Translacja zachodzi poza jądrem, gdy zakończy się jądrowe przetwarzanie pre-mRNA, a cząsteczki mRNA zostaną przetransportowane do cytoplazmy przez pory jądrowe. Translacja jest głównie ułatwiana przez rybosomy znajdujące się na szorstkim retikulum endoplazmatycznym, na zewnętrznej powierzchni otoczki jądrowej lub w cytoplazmie.
- Inicjacja
- Dłużenie
- Terminacja
- Recykling
W translacji odgrywają rolę liczne składniki molekularne, z których najbardziej znany jest rybosom. Ten makromolekularny kompleks składa się z wielu białek i cząsteczek rRNA. Wszystkie rybosomy mają małą i dużą podjednostkę, jednak skład tych podjednostek różni się znacząco między gatunkami. U ludzi, na przykład, mała podjednostka 40S składa się z 33 białek i pojedynczej cząsteczki 18S rRNA, podczas gdy duża podjednostka 60S składa się z 47 białek i trzech rRNA (5S, 5,8S i 28S) .
Pomimo identyfikacji 80 białek związanych z ludzkim rybosomem, tylko 34 występują u innych eukariotów lub prokariotów . Chociaż zaproponowano ogólne funkcje białek związanych z rybosomem, takie jak stabilizacja kompleksu i regulacja translacji, niektórym z nich przypisano również współtranslacyjną modyfikację nowo syntetyzowanych białek (przegląd w ).
Elongacja
W przeciwieństwie do etapów inicjacji, terminacji i recyklingu rybosomów w translacji, mechanizmy napędzające elongację są wysoce konserwowane między eukariontami i bakteriami (przegląd w ).
Rozpoznanie kodonów
Dłużenie zachodzi w kilku dobrze zdefiniowanych etapach, począwszy od rozpoznania kodonów mRNA przez odpowiadające im aminoacylo-tRNA. Asocjacja z mRNA zachodzi poprzez rybosomalne miejsce A i jest zależna od różnych czynników wydłużania. Na przykład, GTPaza eEF1A dostarcza aminoacylo-tRNA do miejsca A po aktywacji przez eEF1B, czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (GEF), który przyspiesza odłączenie GDP od eEF1A.
Tworzenie wiązania peptydowego
Po rozpoznaniu kodonu mRNA powstaje wiązanie peptydowe między aminoacylo-tRNA a peptydylo-tRNA (znajdującym się w rybosomalnym miejscu P). Reakcję tę ułatwia peptydylotransferaza, która sama nie jest białkiem, lecz wysoce konserwowanym rybosomalnym RNA. Mechanizm tworzenia wiązania peptydowego obejmuje raczej zmiany konformacyjne w miejscu aktywnym niż katalizę chemiczną przez grupy rybosomalne i jest napędzany przez korzystną zmianę entropii.
Translokacja mRNA i tRNA przez rybosom
Po utworzeniu wiązania peptydowego miejsce A zostaje zwolnione, gdy zajmujący je peptydylo-tRNA przenosi się do miejsca P dużej podjednostki rybosomalnej, jednocześnie zastępując istniejący deacylowany tRNA, który przenosi się do miejsca E przed wyjściem z rybosomu. Ponieważ łańcuch aminokwasów rośnie, a miejsca A i P są przejściowo zajmowane odpowiednio przez nowe aminoacylo- i peptydylo-tRNA, następuje translokacja mRNA przez rybosom.
Dwa mechanizmy, które charakteryzują się zmianami konformacyjnymi w podjednostkach rybosomalnych, ułatwiają translokację mRNA i tRNA. Są one znane jako „ratcheting” i „swiveling”.
Ratcheting jest obserwowany na wszystkich etapach translacji i widzi małą podjednostkę rybosomalną przechodzącą niewielki obrót, około ~8° w stosunku do dużej podjednostki (przegląd w ). Różni się to od swiveling, który obejmuje ruch domeny głowowej (30S) małej podjednostki. Co ważne, swiveling odgrywa rolę w wewnętrznej aktywności helikazy rybosomu, która jest ważna dla odwijania wtórnych struktur mRNA.
Mechanizmy te ostatecznie zapewniają, że tRNA porusza się w sposób sekwencyjny (od miejsca A do miejsca P do miejsca E) i umożliwiają tworzenie stanów pośrednich, o których wiadomo, że istnieją podczas translokacji mRNA-tRNA. Stany te, zwane również hybrydowymi, można opisać na przykładzie modelu eukariotycznego. Tutaj 3′ końce tRNA zajmujące miejsca A i P przemieszczają się, aby zająć miejsca P i E w podjednostce 60S, podczas gdy 5′ końce, które są związane z mRNA, pozostają zakotwiczone odpowiednio w miejscach A i P podjednostki 40S .
Te stany hybrydowe są chwilowo stabilizowane przez wiązanie eEF2-GTP (EF-G – GTP u prokariotów) do miejsca A rybosomalnego. Hydroliza GTP, w której pośredniczy aktywność GTPazy EF-G lub eukariotycznego homologa eEF2, pozwala na kontynuację mechanizmu zapadania i powoduje przemieszczanie się mRNA oraz 5′ końców tRNA z miejsc A i P odpowiednio do miejsc P i E. Po przywróceniu kanonicznej konformacji A/A, P/P, E/E (60S/40S), EF-G – GDP odłącza się od rybosomu, pozostawiając miejsce A otwarte na przyjęcie nowej cząsteczki aminoacylo-tRNA.
Hydroliza GTP przez EF-G / eEF2, a następnie obrót domeny głowowej dodatkowo wspomaga translokację tRNA, zapobiegając spontanicznemu ruchowi wstecznemu tRNA.
Inicjacja translacji
Pierwszy krok w translacji jest znany jako inicjacja. Tutaj, duże (60S) i małe (40S) jednostki rybosomalne są składane w pełni funkcjonalny rybosom 80S. Jest on umieszczony przy kodonie startu (AUG) nici mRNA, która ma być przetłumaczona (przegląd w ).
Inicjacja jest uważana za krok ograniczający tempo całego procesu i jest przede wszystkim regulowana i koordynowana przez grupę białek znanych jako eukariotyczne czynniki inicjacji (eIF). Czynniki te różnią się wielkością i złożonością; od pojedynczej podjednostki eIF1 o masie 113 kDa do kompleksu eIF3 o masie 700 kDa. U ludzi, co najmniej 12 eIF funkcjonuje wspólnie w celu regulacji inicjacji, z których każdy odgrywa odrębną rolę, co zostało obszernie omówione w .
Inicjacja rozpoczyna się od utworzenia trójskładnikowego kompleksu, który składa się z eIF2, GTP i inicjującego tRNA (Met-tRNAi). Podstawową rolą kompleksu trójskładnikowego jest dostarczenie inicjatora do podjednostki 40S, która następnie tworzy kompleks 43S, zwany również PIC (pre-initiation complex). Przy udziale eIF4G i eIF3, PIC wiąże się na 5′-terminusie mRNA lub w jego pobliżu. Jest to oznaczone przez czapeczkę 7-metyloguanozynową (m7-G-cap). Po związaniu PIC skanuje region 5′ nieulegający translacji, aby zlokalizować kodon inicjacji.
Sekwencja wiodąca 5′-terminusu jest utrzymywana w stanie rozwiniętym przez aktywność helikazy kilku eIF (w tym eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3). Po umieszczeniu podjednostki 40S przy kodonie inicjacji, podjednostka 60S jest rekrutowana do formowania rybosomu 80S, zdolnego do elongacji. W tym momencie kodon startowy mRNA jest zlokalizowany w rybosomalnym miejscu P, a cały kompleks inicjacyjny jest gotowy do wejścia w fazę elongacji.
Należy zauważyć, że podjednostka 40S może wiązać się z mRNA niezależnie od czapeczki m7-G. Najbardziej widocznym tego przykładem, który, jak się uważa, występuje w 5-10% komórkowych mRNA, jest wiązanie się podjednostki 40S z wewnętrznym miejscem wejścia rybosomu (IRES). Inne, niezależne od m7-G-kapsułki ścieżki inicjacji obejmują bocznikowanie, wiązanie, wzmacniacze translacji, element TISU oraz lider poli-adenylanowy w 5′-terminie .
Recykling rybosomów
Ostatnim etapem translacji jest recykling rybosomów, w którym rybosom dzieli się na mniejsze podjednostki i przygotowuje do kolejnej rundy translacji. U eukariotów oznacza to, że rybosom 80S rozdziela się na podjednostki 40S i 60S. Chociaż krok ten oznacza zakończenie procesu translacji, może on również wystąpić z wielu innych powodów, w tym w przypadku niepowodzenia syntezy łańcucha polipeptydowego, napotkania uszkodzonego mRNA lub po złożeniu pustych rybosomów. Co więcej, krok ten jest często opisywany jako początek inicjacji, przy czym kluczowe białko, które ułatwia podział rybosomu, łączy się również z kilkoma czynnikami inicjacji (wykazano, że ABCE1 łączy się z eIF2, eIF3 i eIF5 w modelach drożdżowych).
W eukariotach, recykling rybosomów jest głównie ułatwiany przez ABCE1 (Rli1 w drożdżach), który jest członkiem nadrodziny ABC ATPaz. Białko to, posiadające dwie domeny wiążące nukleotydy oraz unikalną domenę klastrową FeS1, wiąże się do kompleksu postterminacyjnego po odłączeniu RF3-GDP od rybosomu. Związek ten powstaje poprzez interakcję pomiędzy klastrem FeS a eRF1. Co ważne, ACBE1 zawiera również liczne miejsca wiążące, które umożliwiają interakcje pomiędzy podjednostkami rybosomalnymi i różnymi białkami rybosomalnymi. Na przykład, wykazano, że motyw HLH w pierwszej domenie wiążącej nukleotydy wiąże się z 18S rRNA, jak również z rpS24-A . Chociaż dokładny mechanizm, który napędza podział rybosomalny pozostaje niejasny, proponuje się, że u eukariotów jest on wynikiem zmiany konformacyjnej w ABCE1, która jest indukowana przez hydrolizę ATP.
Jak wspomniano wcześniej, uwalnianie peptydów nie jest warunkiem wstępnym do dysocjacji podjednostek rybosomalnych lub do wiązania ABCE1 . Jest to ważne, gdy recykling rybosomów jest indukowany w odpowiedzi na uszkodzenie mRNA lub montaż pustych rybosomów, ponieważ żaden stop-kodon nie zostanie wykryty, aby zainicjować terminację i uwolnienie peptydu. Aby to przezwyciężyć, ABCE1 jest w stanie ułatwić uwalnianie peptydów w sposób podobny do trójskładnikowego kompleksu eRF1-eRF3-GTP, i wykazano, że dzieje się to niezależnie od hydrolizy ATP. Tutaj, hydroliza ATP indukuje zmianę konformacyjną w eRF1, która promuje hydrolizę peptydylo-tRNA.
Ważne jest, że eRF1 i eRF3 mogą być wystarczające do zainicjowania dysocjacji podjednostki; jednak będzie to zachodzić w wolniejszym tempie.
Mechanizmy recyklingu w prokariota są odmienne od tych w eukariota, z główną różnicą jest obecność wyspecjalizowanego czynnika recyklingu rybosomów (RRF), który działa wraz z EF-G do oddzielenia podjednostek rybosomalnych w bakteriach .
Zakończenie translacji
Kolejnym krokiem w procesie translacji jest zakończenie. W tym kroku kodon stop mRNA wskazuje, że żadne dodatkowe aminokwasy nie mają być dodane do rosnącego białka. Terminację u eukariotów ułatwiają tylko dwa czynniki (eRF1 i eRF3) i różni się ona znacznie od procesu u prokariotów, w którym biorą udział trzy czynniki (RF1, RF2 i RF3). U eukariotów, aby elongacja peptydów została pomyślnie zakończona, muszą zajść dwa odrębne procesy: uwolnienie peptydów i utworzenie kompleksu postterminacyjnego. W niektórych przypadkach, gdy translacja musi zakończyć się przed wykryciem kodonu stop, etap terminacji może zostać pominięty, a recykling rybosomów zainicjowany wcześniej. W tym przypadku uwalnianie peptydów będzie ułatwione przez ABCE1 .
Terminacja jest wyzwalana przez wprowadzenie kodonu stop (UAA, UGA lub UAG) do rybosomalnego miejsca A. Kodon ten jest rozpoznawany przez klasę UGA. Kodon ten jest rozpoznawany przez czynnik uwalniający klasy 1 (RF1). U eukariontów czynnik ten (eRF1) wiąże się z rybosomem jako część wstępnie zmontowanego kompleksu trójskładnikowego składającego się z eRF1, eRF3 i GTP . Stop-kodon jest rozpoznawany przez konserwowane motywy znajdujące się na aminokońcu białka, takie jak motyw NIKS .
eRF1 pomaga również w hydrolizie peptydylo-tRNA i uwalnianiu peptydów z centrum peptydylotransferazy (PTC). Dzieje się to w wyniku hydrolizy GTP przez eRF3, która indukuje zmianę konformacyjną w eRF1, która pozwala jego motywowi Gly-Gly-Gln (GGQ), znajdującemu się w domenie „środkowej” (M), wejść do rybosomalnego PTC i ułatwić hydrolizę peptydylo-tRNA. Mechanizm ten różni się u prokariotów, gdzie uwolnienie peptydu jest wymagane do, a więc poprzedza hydrolizę GTP przez RF3.
Po hydrolizie GTP i uwolnieniu peptydu, RF3-GDP dysocjuje z białka, pozostawiając za sobą RF1, który pozostaje związany z rybosomem w tym, co jest znane jako kompleks postterminacyjny . To zasadniczo przygotowuje rybosom do recyklingu rybosomalnego.