Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) jest testem immunologicznym powszechnie stosowanym do pomiaru przeciwciał, antygenów, białek i glikoprotein w próbkach biologicznych. Niektóre przykłady obejmują: diagnostykę zakażenia wirusem HIV, testy ciążowe oraz pomiary cytokin lub rozpuszczalnych receptorów w supernatancie komórkowym lub surowicy. Testy ELISA są zazwyczaj przeprowadzane na płytkach 96-dołkowych, co pozwala na pomiar wielu próbek w jednym eksperymencie. Płytki te muszą być specjalnymi płytkami absorbującymi (np. płytki NUNC Immuno), aby zapewnić przyleganie przeciwciała lub antygenu do powierzchni. Każdy test ELISA mierzy określony antygen, a zestawy do różnych antygenów są szeroko dostępne.
Ten test ELISA przedstawiony na rycinie 1 jest znany jako test kanapkowy ELISA, w którym do wykrywania wydzielanych produktów, np. cytokin, stosuje się dwa zestawy przeciwciał. Metoda jest etapowa w przedstawionej kolejności. Pierwszym krokiem jest pokrycie płytki ELISA przeciwciałem wychwytującym, nadmiar niezwiązanego przeciwciała jest następnie wypłukiwany z płytki. Przeciwciało wychwytujące jest przeciwciałem hodowanym przeciwko antygenowi zainteresowania.
Rysunek 1. Metoda ELISA. Powyżej opisano test ELISA typu sandwich, przedstawiający etapy testu, ponumerowane w kolejności 1-4.
Następnie dodawana jest próbka (np. mocz, surowica lub supernatant komórkowy). Każdy antygen znajdujący się w próbce zwiąże się z przeciwciałem wychwytującym, które już pokrywa płytkę. Próbki są zwykle dodawane w dwóch lub trzech powtórzeniach (aby umożliwić analizę statystyczną) i w różnych stężeniach, aby zagwarantować, że mieszczą się one w zakresie poziomów wykrywania testu. Ponownie każdy nadmiar próbki jest wypłukiwany z płytki.
W kroku 3 dodawane jest przeciwciało wykrywające. Przeciwciało to jest znakowane enzymem, zwykle peroksydazą rzodkiewnika końskiego lub fosfatazą alkaliczną. Przeciwciało detekcyjne wiąże się z każdym docelowym antygenem już związanym z płytką. Wreszcie, do płytki dodawany jest substrat. Testy ELISA są zazwyczaj chromogenne, wykorzystując reakcję, która przekształca substrat (np. TMB lub ABTS) w barwny produkt, który można zmierzyć przy użyciu czytnika płytek.
Określenie stężenia antygenu w próbce wymaga wytworzenia krzywej wzorcowej przy użyciu antygenów o znanym stężeniu (przedstawionych na rysunku 2). Stężenie antygenu w próbce może być następnie obliczone przy użyciu gęstości optycznej (OD).
Rysunek 2. Typowa krzywa standardowa. Przedstawiona jest krzywa standardowa dla testu ELISA IFN-γ. Aby obliczyć stężenie antygenu w próbce, należy przygotować krzywą standardową z użyciem roztworu o znanym stężeniu.
.