PMC

Restriction-modification

Systemy RM (ang. restriction-modification) występują powszechnie w królestwie prokariotycznym, gdzie służą jako systemy obronne przed obcym DNA. Obecnie znanych jest 47 systemów typu I, 3320 typu II i osiem typu III. R. Roberts (Beverly, MA) zwrócił uwagę, że do niedawna enzymy restrykcyjne identyfikowano pozyskując bakterie z kolekcji kultur i próbek środowiskowych i analizując je pod kątem aktywności restrykcyjnej. Obecnie możliwe jest przesiewanie nowych sekwencji DNA w poszukiwaniu genów metylotransferaz DNA (MTase), które można zidentyfikować na podstawie konserwatywnych motywów, a następnie poszukiwanie genów towarzyszących. Są to dobrzy kandydaci na geny endonukleaz restrykcyjnych, ponieważ geny metylotransferaz DNA i endonukleaz restrykcyjnych są często powiązane. Ostatnie projekty genomowe pozwoliły zidentyfikować w ten sposób niespodziewanie dużą liczbę potencjalnych systemów RM. Na przykład, w genomie Helicobacter pylori zidentyfikowano 25 różnych genów MTazy, a niektóre z nich były powiązane z genami enzymów restrykcyjnych. Przesiewanie baz danych może więc stać się bardzo wydajną metodą poszukiwania enzymów restrykcyjnych o nowych specyficznościach. A. Piekarowicz (Warszawa, Polska) podał przykład takiego podejścia, które doprowadziło do identyfikacji nowego enzymu restrykcyjnego typu IC, NgoAXVI.

Enzymy restrykcyjne typu I i typu III, jak również metylozależny enzym McrBC, wymagają dwóch miejsc rozpoznawania i zależą od hydrolizy ATP (McrBC: GTP) do rozszczepienia DNA (przegląd w Rao i in., 2000). Rozszczepienie następuje, gdy dwa takie enzymy zderzają się podczas translokacji DNA, co wyjaśnia wymóg dwóch miejsc (rysunek (rysunek2).2). T. Bickle (Bazylea, Szwajcaria) wykazał, że enzymy typu I oraz McrBC mogą być również stymulowane do rozszczepiania DNA, gdy natrafią na niespecyficzny blok. Enzymy typu III, w przeciwieństwie do nich, są hamowane przez takie bloki, ponieważ każdy enzym translokacyjny tnie tylko jedną nić i wymaga współpracy innego enzymu do rozszczepienia obu nici DNA.

Fig. 2. Model aktywacji enzymów restrykcyjnych, które do rozszczepienia DNA wymagają ATP (lub GTP). Po związaniu dwóch cząsteczek enzymu (lub kompleksu) z dwoma miejscami rozpoznawania na liniowej cząsteczce DNA, DNA ulega translokacji w aktywnym, zależnym od energii procesie, który wymaga ATP lub GTP, w zależności od systemu. W ten sposób DNA ulega zapętleniu. Rozszczepienie zachodzi po zderzeniu dwóch kompleksów translokacyjnych, w przypadkowych miejscach w pobliżu miejsc rozpoznania (enzymy typu III i McrBC) lub dalej od nich (enzymy typu I).

Pomimo, że większość enzymów restrykcyjnych typu II to homodimery, które oddziałują z jedną kopią swojego palindromicznego miejsca rozpoznania, istnieją podtypy wymagające współpracy dwóch miejsc (przegląd w Pingoud i Jeltsch, 1997). Jak zauważył S. Halford (Bristol, UK), dotyczy to nie tylko enzymów typu IIe, jak NaeI, ale także enzymów typu IIf, jak SfiI, oraz enzymów typu IIS, jak FokI. Enzymy typu IIf są homotetramerami z dwoma oddzielnymi miejscami wiązania DNA, każde tworzone przez dwie podjednostki. SfiI jest aktywny tylko wtedy, gdy oba miejsca wiążące DNA są zajęte, co prowadzi do jednoczesnego rozszczepienia obu miejsc. W przypadku FokI, który składa się z domeny rozszczepiającej i domeny rozpoznającej, wykazano wcześniej, że dimeryzacja enzymu na DNA jest konieczna, aby doszło do rozszczepienia. Obecnie Halford wykazał, że do efektywnego rozszczepienia wymagane są dwa miejsca rozpoznawania, ponieważ każda z domen rozpoznawania musi oddziaływać z sekwencją rozpoznawczą. Wszystkie trzy typy enzymów działają optymalnie z dwoma miejscami na tym samym DNA, gdzie zatrzymują DNA pomiędzy miejscami w pętli.

Atypowe enzymy restrykcyjne typu II nadal są odkrywane. BbvCI jest heterodimerycznym enzymem restrykcyjnym, który rozpoznaje asymetryczną sekwencję. Pojedyncze podjednostki są nieaktywne, ale aktywne razem. Umożliwia to tworzenie specyficznych enzymów koduj±cych poprzez inaktywację jednej z podjednostek za pomoc± mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, jak to opisał G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Wilno, Litwa) uzyskał podobny wynik dla heterodimerycznego enzymu restrykcyjnego Bpu10I. Udało mu się również rozluźnić specyficzność substratową Eco57I, monomerycznego enzymu restrykcyjno-modyfikacyjnego, który posiada pojedynczą domenę rozpoznającą cel. W badaniach tych zastosowano mutagenezę losową w celu wygenerowania wariantu, który oddziałuje nie tylko z kanonicznym miejscem CTGAAG, ale również z miejscami CTGGAG. Molekularna podstawa tej luźnej specyficzności nie została jeszcze ustalona. V. Siksnys (Wilno, Litwa) doniósł o odkryciu nowego enzymu restrykcyjnego typu IIs, BfiI, który nie jest zależny od jonów metali dwuwartościowych w procesie rozszczepiania. Enzym ten wykazuje podobieństwo sekwencyjne do niespecyficznej nukleazy z Salmonella typhimurium i przypuszczalnie wykorzystuje podobny mechanizm katalityczny.

A. Pingoud (Giessen, Niemcy) omówił mechanizm rozszczepiania DNA przez enzymy restrykcyjne typu II i endonukleazy homingowe, które pełnią wspólną funkcję, ale na ogół mają różną budowę i przypuszczalnie stosują różne mechanizmy rozszczepiania. Pomimo, że dostępne s± szczegółowe informacje o strukturze wielu enzymów restrykcyjnych maj±cych wspólny motyw katalityczny, nie ma zgody co do mechanizmu katalitycznego czy liczby jonów Mg2+ bior±cych udział w katalizie. W zasadzie to samo odnosi się do innych fosforylotransferaz z centrum katalitycznym podobnym do enzymu restrykcyjnego. Przykładami takich białek są enzym naprawczy Vsr (E. coli) i resolwaza Hjc (Pyrococcus furiosus). Struktura krystaliczna tego ostatniego została przedstawiona przez K. Morikawę (Osaka, Japonia) (Rysunek (Rysunek 3).3). Natomiast mechanizm rozszczepiania DNA przez endonukleazy homingowe z rodziny HNH, np. I-PpoI, wydaje się być lepiej poznany, ponieważ dostępne są informacje strukturalne zarówno dla wolnego enzymu, jak i kompleksów enzym-substrat oraz enzym-produkt, a także szczegółowe informacje biochemiczne dla tego i pokrewnych enzymów z nadrodziny „ββα-Me finger”. Enzymy te wymagają jonu Mg2+ jako kofaktora, który jest związany z konserwowanym Asn. Atakujący jon hydroksylowy jest generowany przez konserwowany His, w stabilizację stanu przejściowego zaangażowany jest konserwowany Arg, a protonowanie grupy opuszczającej jest zapewnione przez cząsteczkę wody ze sfery hydratacyjnej jonu Mg2+.

Bakterie rozwinęły systemy RM do zwalczania bakteriofagów. Te z kolei rozwinęły różne sposoby ucieczki przed ograniczeniami ze strony bakteryjnych systemów RM. D. Dryden (Edinburgh, UK) przedstawił wyniki analizy biochemicznej białka genu 0.3 bakteriofaga T7, które jest inhibitorem enzymów modyfikujących restrykcję typu I. Białko to wiąże się stechiometrycznie z białkiem 0.3 bakteriofaga T7. Białko to wiąże się stechiometrycznie z enzymem restrykcyjnym i, ze względu na swoją wydłużoną formę i ujemny ładunek powierzchniowy, przypuszczalnie całkowicie wypełnia miejsce wiązania DNA przez enzym i w ten sposób zapobiega wiązaniu DNA.

Systemy RM składają się z endonukleaz restrykcyjnych i metylotransferaz DNA (MTases) (przegląd w Cheng, 1995; Robertson i Wolffe, 2000). Ponieważ jednak wzór metylacji DNA dodaje informację do DNA, a tym samym rozszerza jego możliwości kodowania, MTazy są nie tylko towarzyszami enzymów restrykcyjnych w systemach RM, ale pełnią wiele innych istotnych funkcji. U prokariotów odgrywaj± one rolę w naprawie DNA oraz regulacji ekspresji genów i replikacji DNA. U eukariotów metylacja DNA prowadzi na ogół do wyciszenia transkrypcyjnego genów. Przyczynia się do procesów epigenetycznych, takich jak inaktywacja chromosomu X, imprinting i regulacja genów. Wraz z odkryciem, że kilka MTaz DNA jest niezbędnych dla rozwoju u myszy, znaczenie metylacji DNA stało się powszechnie akceptowane.

X. Cheng (Atlanta, GA) przedstawił strukturę białka Dnmt2, która może być pierwszą strukturą eukariotycznej MTazy DNA. Białko ma fałd MTazowy i posiada wszystkie charakterystyczne motywy katalityczne, ale wydaje się być pozbawione jakiejkolwiek aktywności katalitycznej. Rodzi to pytania, czy jest to rzeczywiście enzym i co jest jego substratem (DNA, RNA czy coś innego). Kolejne dyskusje na temat enzymów eukariotycznych prowadzone przez Cheng i A. Jeltsch (Giessen, Niemcy) dotyczyły enzymów Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b. Obaj prelegenci przedstawili wyniki uzyskane z obciętymi białkami i wyizolowanymi domenami tych ogromnych enzymów (licz±cych do 1700 reszt aminokwasowych), jak również zaprezentowali wyniki dotycz±ce analizy enzymatycznej oczyszczonych enzymów. Ponieważ domena katalityczna Dnmt1 (∼500 reszt aminokwasowych) nie jest aktywna w postaci izolowanej, musi ona pozostawać pod ścisłą kontrolą innych części enzymu. Interakcja ta może być niezbędna do zapewnienia wysokiej specyficzno¶ci dla hemimetylowanego DNA. Pomimo postępu w tej dziedzinie, proces metylacji DNA u eukariotów, a w szczególności mechanizmy tworzące wzór metylacji DNA, jest nadal słabo poznany.

Nieco więcej wiadomo o metylacji DNA u prokariotów. R. Gumport (Urbana, IL) przedstawił strukturę prokariotycznej MTazy M.RsrI, potwierdzając przypuszczenia, że domeny katalityczne wszystkich MTaz mają wspólną architekturę. S. Klimasauskas (Wilno, Litwa), D.N. Rao (Bangalore, Indie), Gumport i Jeltsch omówili enzymologię molekularną czterech prokariotycznych MTaz (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI i M.EcoRV). Cykl katalityczny tych enzymów obejmuje wiązanie DNA i kofaktora, lokalizację i rozpoznanie miejsca docelowego oraz zmiany konformacyjne kompleksu, w tym przerzucanie zasad i przenoszenie grup metylowych (Rysunek (Rysunek4).4). Różnice w szczegółach stały się widoczne; np. kolejność wiązania substratu i kofaktora oraz etap ograniczający szybkość reakcji różnią się w różnych MTazach. 2-aminopuryna okazała się dobrym narzędziem do analizy kinetyki zmian konformacyjnych, jakim ulega DNA w kompleksie z MTazami, w tym przerzucania zasad.

Ryc. 4. Mechanizm lokalizacji miejsca docelowego przez endonukleazy restrykcyjne i metylotransferazy DNA. Najpierw DNA jest wiązane niespecyficznie, następnie miejsce docelowe jest lokalizowane poprzez ułatwioną dyfuzję (ślizganie i przeskakiwanie) na DNA. Kontakty z miejscami docelowymi indukują zmiany konformacyjne enzymu i DNA, co z kolei uruchamia katalizę. Mechanizm ten jest wspólny dla większości enzymów specyficznie oddziałujących z DNA.

.