Różnicowanie dzika i świni domowej w żywności poprzez ukierunkowanie na dwa loci genowe metodą PCR w czasie rzeczywistym

Projektowanie primerów i sond

Do projektowania primerów i sond wybraliśmy polimorfizmy, które już zostały zgłoszone, aby umożliwić dyskryminację dzika i świni domowej. Zaczęliśmy od SNP g.299084751 C > T w genie NR6A1, który okazał się być związany z liczbą kręgów piersiowych i lędźwiowych: dziki, które są homozygotyczne dla allelu typu dzikiego g.299084751 C, mają 19 kręgów, podczas gdy świnie domowe, które są homozygotyczne dla g.299084751 T, mają 21-23 kręgi. W badaniu Fontanesi et al., ten SNP został wykorzystany do rozróżnienia dzika i świni domowej metodą PCR-RFLP10. Naszym celem było zaprojektowanie jednej pary primerów do amplifikacji regionu docelowego zarówno u dzika jak i świni domowej oraz dwóch sond TaqMan, specyficznych odpowiednio dla allelu dzika (g.299084751 C) i allelu świni domowej (g.299084751 T). Test dupleksowy powinien umożliwić jednoczesne wykrywanie dzika i świni domowej w tej samej studzience. W sumie zaprojektowaliśmy cztery primery forward, trzy primery reverse, cztery sondy dla dzika i jedną dla świni domowej i połączyliśmy je w 21 systemów primer/sonda (Chr1a – u, Tabela Uzupełniająca 1). Układy primer/sonda Chr1a celowały w górną, a układy primer/sonda Chr1b-u w dolną nić genu NR6A1. W serii eksperymentów sprawdziliśmy, czy układy primer/sonda były specyficzne dla dzika lub wykazywały reaktywność krzyżową z rasami/rasami krzyżowymi świń domowych. Układ primer/sonda Chr1a dał wartość ΔCt ≥ 10.56 pomiędzy świnią domową a dzikiem (Tabela Uzupełniająca 2). Dla układów primer/sonda Chr1i – o, wartości ΔCt wahały się od 8,65 do 11,19. Układy primer/probe Chr1b – h i Chr1p – t nie powodowały wzrostu sygnału fluorescencji dla ras/ krzyżówek świń domowych. Ponieważ układ primer/sonda Chr1q dał najniższą wartość Ct (24.77; n = 2) dla dzika, przetestowaliśmy jego przydatność w połączeniu z sondą TaqMan dla świni domowej w formacie testu duplex (układ primer/sonda Chr1u, Tabela Uzupełniająca 1). Ponieważ wartości Ct zarówno dla dzika (26,21, n = 2) jak i świni domowej (27,90, n = 2) były zadowalające, wszystkie dalsze eksperymenty PCR ukierunkowane na SNP g.299084751 C > T były wykonywane z systemem primer/probe Chr1u. W dalszej części test duplex real-time PCR nazywany jest assayChr1, składający się z testu dla świni domowej, assayChr1D, obejmującego primer forward Chr1f4, reverse primer Chr1r2 i sondę Chr1p1D, oraz assay dla dzika, assayChr1W, obejmującego primer forward Chr1f4, reverse primer Chr1r2 i sondę Chr1p4W (Rys. 1A).

Częściowe sekwencje (A) genu NR6A1 na chromosomie 1 niosącego SNP g.299084751 C > T, ukierunkowanego przez test dupleksowy „assayChr1”, i (B) chromosomu 9 niosącego SNP g.118314929 A > G (rs81416363), ukierunkowanego przez dwa testy jednopróbkowe „assayChr9D” i „assayChr9W”. Strzałki wskazują pozycje primerów (ciemnoszare) i sond (jasnoszare). (A) Duplex assayChr1 zawierał primer forward Chr1f4, primer reverse Chr1r2, sondę Chr1p4W i sondę Chr1p1D. (B) Test jednopróbkowyChr9D zawierał primer forward Chr9f8, primer reverse Chr9r17D i sondę Chr9p2; test jednopróbkowyChr9W zawierał primer forward Chr9f8, primer reverse Chr9r12W i sondę Chr9p2. Zasady specyficzne dla danego podgatunku zaznaczono pogrubioną czcionką (pionowe czerwone strzałki), a zasady niedopasowane – niebieską (pionowe niebieskie strzałki).

Ponieważ z literatury dowiedzieliśmy się, że siła dyskryminacji poprzez ukierunkowanie tylko na jeden polimorfizm jest najprawdopodobniej niewystarczająca, poszukiwaliśmy kolejnego odpowiedniego locus genowego. Badając 20 SNP pod kątem ich przydatności do rozróżniania pomiędzy dzikiem a świnią domową, Beugin et al. znaleźli SNPs rs80864596 (intergeniczny, chromosom 5), rs80796712 (kinaza syntazy glikogenu 3-beta, chromosom 13) i rs81416363 (intergeniczny, chromosom 9), aby wykazać najwyższą moc dyskryminacji11. Dlatego też wybraliśmy te trzy SNP do zaprojektowania systemów primer/probe. W porównaniu z projektowaniem primera/sondy dla SNP g.299084751 C > T, zastosowaliśmy inną strategię. Zamiast umieszczać bazę specyficzną dla podgatunku w sondzie, umieściliśmy ją w przedostatnim miejscu od 5′ końca primera forward lub reverse. W celu zwiększenia specyficzności, wprowadziliśmy celowe niedopasowania zasad. Ta tak zwana technika MAMA (mismatch amplification mutation assay)12,13 ma tę zaletę, że jest raczej efektywna kosztowo, ponieważ jedna i ta sama sonda może być testowana z wieloma starterami różniącymi się pozycją niedopasowania. W pierwszej serii eksperymentów wprowadziliśmy niedopasowaną bazę albo na 3. lub 6. pozycji od 3′ końca startera niosącego bazę specyficzną dla danego podgatunku. Kiedy opracowaliśmy testy PCR w czasie rzeczywistym odpowiednio dla jelenia szlachetnego, daniela i sarny14,15,16, strategia ta okazała się skuteczna. Jednakże w obecnym badaniu żaden z systemów primer/sonda (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Tabela Uzupełniająca 1) nie pozwolił na odróżnienie świni domowej od dzika (Tabela Uzupełniająca 3). Najlepsze wyniki (wartość ΔCt pomiędzy rasami/ krzyżówkami świń domowych i dzików ≥5,24) uzyskano przy zastosowaniu układu primer/sonda Chr9j. W tym systemie primer/sonda, celującym w SNP rs81416363 na chromosomie 9, niedopasowana baza była zlokalizowana w 3 pozycji od 3′ końca primera (TTCACG → TTCCCG). W celu zwiększenia specyficzności wprowadzono kolejne niedopasowanie w 4 (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) lub 5 pozycji (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) od 3′ końca primera. Wprowadzenie dodatkowych niedopasowań okazało się skuteczne. Przy zastosowaniu układu primer/sonda Chr9r (Tabela uzupełniająca 1) uzyskaliśmy zarówno najniższą wartość Ct dla dzika (22,09; n = 2), jak i najwyższą wartość ΔCt (10,52) pomiędzy krajowymi rasami/ krzyżówkami świń i dzików (Tabela uzupełniająca 3). To badanie PCR w czasie rzeczywistym dla dzików, ukierunkowane na SNP rs81416363 zlokalizowany na chromosomie 9, było oparte na systemie primer/sonda Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Następnie zastosowaliśmy strategię MAMA do opracowania odpowiedniego badania PCR w czasie rzeczywistym, ukierunkowanego na SNP rs81416363 zlokalizowany na chromosomie 9, dla świni domowej. Zlokalizowaliśmy bazę specyficzną dla świni domowej na przedostatniej bazie od 5′ końca startera i niedopasowaną bazę na 3. pozycji od 3′ końca (układy starter/sonda Chr9v – x; Tabela uzupełniająca 1). Jednakże, wprowadzenie jednej niedopasowanej zasady nie było wystarczające, aby umożliwić różnicowanie świni domowej i dzika. Wprowadzenie niedopasowanych zasad w 3 i 5 pozycji od 3′ końca startera (układy starter/sonda Chr9y – ag) prowadziło do wartości ΔCt ≥ 4,83. Gdy niedopasowania znajdowały się na pozycjach 3 i 4 (układy primer/probe Chr9ah – aj), wartość ΔCt wynosiła ≥5,85. Wprowadzenie trzech kolejnych niedopasowanych zasad obok zasady specyficznej dla danego podgatunku (układy primer/baba Chr9ak – am) pozwoliło na zwiększenie specyficzności. Układ starter/sonda Chr9ak, w którym niedopasowania znajdowały się w pozycjach 3, 4 i 5 (TTCATG → TGGTTG) dał najwyższą wartość ΔCt wynoszącą ≥9,97. Dlatego wszystkie dalsze eksperymenty przeprowadzono z układem primer/sonda Chr9ak. W dalszej części dwa testy jednopróbkowe ukierunkowane na SNP rs81416363 na chromosomie 9 są określane jako assayChr9D, obejmujący starter forward Chr9f8, starter reverse Chr9r17D i sondę Chr9p2, oraz assayChr9W, obejmujący starter forward Chr9f8, starter reverse Chr9r12W i sondę Chr9p2 (Rys. 1B).

Optymalizacja stężenia i stosunku primer/sonda

Wszystkie przedstawione powyżej wyniki uzyskano przy stężeniach primera i sondy wynoszących odpowiednio 500 nM i 200 nM (układy primer/sonda skierowane na chromosom 1) oraz 200 nM i 100 nM (układy primer/sonda skierowane na chromosomy 5, 9 i 13). Następnie zbadano, czy można zwiększyć specyficzność testów PCR w czasie rzeczywistym poprzez optymalizację stężenia i stosunku primera do sondy. W przypadku testuChr1 optymalne stężenia primera i sondy wynosiły odpowiednio 1000 nM i 200 nM (Tabela 4). W przypadku testuChr9W iChr9D, nadmiar primera niosącego zarówno bazę specyficzną dla danego podgatunku, jak i niedopasowane bazy, skutkował wyższymi wartościami ΔCt pomiędzy reagującymi krzyżowo podgatunkami a gatunkiem docelowym. Najwyższą selektywność assayChr9W i assayChr9D uzyskano przy stężeniach primera forward/reverse primera/sondy wynoszących odpowiednio 12,5/200/50 nM i 62,5/800/50 nM.

Testy reaktywności krzyżowej

Następnie przeprowadziliśmy testy reaktywności krzyżowej z izolatami DNA pochodzącymi od dzika, różnych ras/ krzyżówek świń domowych i dalszych 22 gatunków zwierząt wymienionych w Tabeli Uzupełniającej 5. Rysunki 2A-D przedstawiają krzywe amplifikacji uzyskane odpowiednio z analiząChr9W, analiząChr9D, analiząChr1W i analiząChr1D. TestChr9W wykazywał niewielką reaktywność krzyżową ze świniami domowymi, jeleniami sika, kozami alpejskimi, owcami, kozami i kozicami (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), a testChr9D z dzikami, jeleniami sika, łosiami, końmi i indykami (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). W przeciwieństwie do testów ukierunkowanych na SNP rs81416363 na chromosomie 9, assayChr1 nie wykazał żadnej reaktywności krzyżowej (z wyjątkiem assayChr1W dla sarny tylko w jednej z czterech replik). Analizowaliśmy również izolaty DNA z 50 gatunków roślin powszechnie stosowanych jako składniki żywności (Tabela uzupełniająca 6). Żaden z testów nie wykazał reaktywności krzyżowej z żadnym z gatunków roślin.

Wyniki uzyskane podczas wykonywania testów reaktywności krzyżowej z izolatami DNA (10 ng/µL) z 22 gatunków zwierząt i dzika/świni domowej. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W i (D) assayChr1D.

Screening various commercial master mixes for their applicability

W kolejnej serii eksperymentów zbadaliśmy, czy rodzaj komercyjnego master mixu wpłynął na selektywność testów. Analizowaliśmy izolaty DNA pochodzące od 23 gatunków zwierząt, w tym 3 osobników dzika i 11 ras/ krzyżówek świni domowej, stosując łącznie pięć mieszanek wzorcowych pochodzących od różnych dostawców. Mieszanki wzorcowe i odpowiednie programy temperaturowe są podane w Tabeli 7. Ogólnie rzecz biorąc, rodzaj mieszaniny wzorcowej wpłynął zarówno na bezwzględne wartości Ct, jak i na wartości ΔCt pomiędzy gatunkami docelowymi i reagującymi krzyżowo (pod)gatunkami. Jednakże, testy real-time PCR miały wpływ w różnym stopniu. W przypadku badaniaChr9W, na przykład, mieszaniny 2 i 3 dały wyższe wartości Ct niż mieszaniny 1 (standardowa mieszanina wzorcowa w obecnym badaniu), 4 i 5 (Ct ± SD (n = 6): mieszanina 1: 25,03 ± 0,15; mieszanina 2: 31,17 ± 1,70; mieszanina 3: 28,43 ± 0,13; mieszanina 4: 26,64 ± 0,10; mieszanina 5: 26,64 ± 0,17). W przypadku oznaczeniaChr9D rodzaj mieszaniny wzorcowej miał wpływ na wartości ΔCt, a tym samym na selektywność oznaczenia. Wartości ΔCt uzyskane z master mix 1, 2, 3 i 4 wynosiły odpowiednio ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 i ≥ 5,86, natomiast z master mix 5 nie zaobserwowano w ogóle reaktywności krzyżowej. W przypadku oznaczeniaChr1, dość podobne wartości Ct uzyskano przy użyciu mieszanin wzorcowych 1, 3 i 4. Natomiast mieszaniny wzorcowe 2 i 5 nie spowodowały powstania żadnych produktów, najprawdopodobniej dlatego, że te mieszaniny nie są odpowiednie do multipleksowania. W oparciu o te wyniki, zdecydowanie zalecamy sprawdzenie możliwości zastosowania, jeśli zamierza się użyć innego rodzaju mieszaniny wzorcowej.

Odporność

Odporność testów real-time PCR badano zmieniając temperaturę annealingu ±1 °C i objętość mieszaniny reakcyjnej na studzienkę o ±5% oraz stosując dwa różne cyklery real-time PCR. Doświadczenia przeprowadzono z izolatami DNA pochodzącymi od dzika, świni domowej i sarny. Dla testówChr9W iChr9D, wartości Ct były bardzo podobne do tych uzyskanych w warunkach standardowych (wartości ΔCt <1,00), z wyjątkiem sytuacji, gdy temperatura annealingu została zwiększona do 61 °C (wartości ΔCt odpowiednio ≤2,16 i ≤1,57). Przy wartościach ΔCt ≤0,77, testChr1 okazał się jeszcze bardziej odporny. Ani zmniejszenie całkowitej objętości reakcji, ani zastosowanie innego cyklera real-time PCR nie miało istotnego wpływu na wartości Ct, co świadczy o solidności testów real-time PCR.

Zakres roboczy, zakres liniowy i wydajność amplifikacji

Przez analizę izolatu DNA dzika (211 µg/mL) i dwóch izolatów DNA świni domowej (158 µg/mL i 160 µg/mL) seryjnie rozcieńczonych w wodzie (1:2-1:524,288), assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W i assayChr1D były liniowe pomiędzy 211 µg/mL a 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL i 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL i 6 ng/mL (R2 = 0,9994) oraz 160 µg/mL i 10 ng/mL (R2 = 0,9988), odpowiednio (Rys. 3A). Wydajność amplifikacji obliczona na podstawie nachylenia krzywych standardowych wynosiła odpowiednio 83%, 96%, 93% i 95%. Dodatkowo, zakres liniowości oceniano analizując izolaty DNA dzika i świni domowej seryjnie rozcieńczone w DNA spermy śledzia. Dla oznaczeńChr9W iChr9D liniowość wynosiła odpowiednio od 20 µg/mL do 20 ng/mL (R2 = 0,9988) i od 20 µg/mL do 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (Rys. 3B). W przypadku testówChr1W iChr1D liniowość mieściła się odpowiednio w zakresie od 20 µg/mL do 5 ng/mL (R2 = 0,9978) i od 20 µg/mL do 10 ng/mL (R2 = 0,9988). Wydajność amplifikacji obliczona na podstawie nachylenia krzywych standardowych wynosiła odpowiednio 76%, 90%, 97% i 101%.

Zakres liniowości czterech testów, (A) oznaczanych w wodzie jako tło i (B) oznaczanych w DNA spermy śledzia jako nie docelowe DNA tła.

Wyniki te wskazują, że zakres roboczy oznaczeń PCR w czasie rzeczywistym jest prawie identyczny, podczas gdy zakres liniowości jest węższy dla oznaczeń ukierunkowanych na chromosom 9 niż dla oznaczeń ukierunkowanych na chromosom 1. Wszystkie wydajności amplifikacji mieściły się między 90 % a 110 %, zgodnie z zaleceniami wytycznych ENGL17, z wyjątkiem testuChr9W (83 % w wodzie, 76 % w spermie śledzia). Niższa wydajność amplifikacji testuChr9W jest najprawdopodobniej spowodowana zmniejszoną stabilnością wiązania primera z powodu niedopasowań, wprowadzonych w celu zwiększenia selektywności dla docelowego gatunku zwierzęcia.

Granica wykrywalności (LOD) w DNA spermy śledzia i DNA świni jako DNA tła

LOD zdefiniowano jako najniższe stężenie DNA, które spowodowało wzrost sygnału fluorescencji w co najmniej 19 z 20 powtórzeń. Ponadto, wartość Ct powinna być poniżej wartości Ct uzyskanej dla gatunków reagujących krzyżowo.

W DNA spermy śledzia, LOD testuChr9D (1,0%, w/w, Rys. 4A) była nieco wyższa niż LOD pozostałych trzech testów (0,2%, w/w, Rys. 4B-D). Wyższa LOD dla testuChr9D jest spowodowana reaktywnością krzyżową z dzikiem (wartość ΔCt między dzikiem a świnią domową tylko ≥8,41).

Określenie LOD poprzez analizę seryjnych rozcieńczeń (A-D) mieszanin DNA zawierających DNA dzika lub świni domowej w DNA spermy śledzia oraz (E-H) mieszaniny DNA zawierającej DNA dzika w DNA świni domowej lub DNA świni domowej w DNA dzika jako DNA tła. (A,E) uzyskano przy użyciu testuChr9D, (B,F) przy użyciu testuChr9W, (C,G) przy użyciu testuChr1D i (D,H) przy użyciu testuChr1W. Pomiary przeprowadzono w 20 powtórzeniach. Kółka reprezentują indywidualne wartości Ct, linie poziome oznaczają wartości średnie.

Dodatkowo, określiliśmy LOD testów real-time PCR dla dzika, assayChr1W i assayChr9W, w DNA świni domowej jako tle, oraz testów dla świni domowej, assayChr1D i assayChr9D, w DNA dzika jako tle. Przy 2%, 0.2%, 5% i 2% (w/w), wartości LOD testuChr9D (Rys. 4E), testuChr9W (Rys. 4F), testuChr1D (Rys. 4G) i testuChr1W (Rys. 4H) były raczej różne. Wyższa wartość LOD dla testuChr1D w obecności DNA dzika była spowodowana tłumieniem sygnału, najprawdopodobniej z powodu konkurencji dwóch sond do sekwencji docelowej w formacie testu dupleksowego. Aby zbadać tłumienie sygnału bardziej szczegółowo, analizowano mieszaniny DNA zawierające albo 25% (w/w) DNA dzika w DNA świni domowej, albo 25% (w/w) DNA świni domowej w DNA dzika, oprócz kontroli pozytywnych (odpowiednio DNA dzika i DNA świni domowej).

Gdy porównaliśmy kontrole pozytywne ze standardami rozcieńczonymi w stosunku 1:4 zawierającymi nie docelowe DNA, nie znaleźliśmy różnicy w krzywych amplifikacji (wartości ΔRn) dla testuChr9W i testuChr9D (Rys. 5A,B). Jednakże, w przypadku assayChr1W i assayChr1D, sygnały fluorescencji (wartości ΔRn) uzyskane dla kontroli pozytywnej były wyższe niż te uzyskane dla standardu rozcieńczonego w stosunku 1:4 przy tym samym stężeniu docelowego DNA (Rys. 5C,D).

Krzywe amplifikacji (w widoku półlogarytmicznym) uzyskane dla mieszanin DNA (20 ng/µL) zawierających 25% (w/w) podgatunku docelowego (dzik lub świnia domowa) i 75% (w/w) podgatunku nie docelowego (dzik lub świnia domowa) oraz ich seryjnych rozcieńczeń (1:4 do 1:1,024). Izolaty DNA (5 ng/µL) pochodzące odpowiednio od dzika i świni domowej wykorzystano jako kontrole. PróbaChr9W (A) i próbaChr9D (B) wykazują reaktywność krzyżową z podgatunkami nie będącymi przedmiotem zwalczania. TestyChr1W (C) iChr1D (D) wykazują tłumienie sygnału w obecności podgatunków niebędących celem.

Powtarzalność

Powtarzalność testów real-time PCR badano analizując mieszaniny ekstraktów mięsnych zawierające 30% (w/w) docelowego DNA i 70% (w/w) DNA podgatunków niebędących celem, jak również ich seryjne rozcieńczenia, w duplikatach pięć razy w ciągu czterech różnych dni. RSD wartości Ct wynosiło ≤1,0% (badanieChr1W), ≤1,9% (badanieChr9W), ≤2,3% (badanieChr1D) i ≤3,5% (badanieChr9D), wykazując wysoką powtarzalność testów.

Analiza próbek od osobników dzików i świń domowych

Atesty real-time PCR zastosowano do analizy próbek od 64 osobników świń domowych, w tym 14 ras i 6 krzyżówek (Fig. 6A). Dodatkowo, przeanalizowaliśmy łącznie 30 próbek od dzików z 5 różnych krajów (Austria, Estonia, Niemcy, Rumunia i USA, Ryc. 6B). W przypadku jednego osobnika dzika z Europy, dokładne pochodzenie nie było znane. Każda próbka była analizowana w co najmniej czterech powtórzeniach. Do każdej płytki PCR dodawano kontrolę pozytywną (mieszanina DNA, 10 ng/µL), zawierającą podgatunek docelowy w takim samym stężeniu jak LOD, zapewniając wartość Ct cut-off.

Wyniki uzyskane dla (A) 64 próbek świń domowych i (B) 30 próbek dzików. Pomiary przeprowadzono w co najmniej czterech powtórzeniach.

Gdy analizowaliśmy kontrole pozytywne w 14 powtórzeniach, średnia ± SD wartości Ct wynosiła 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) i 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). Z wyjątkiem badaniaChr9D, wszystkie próbki skutkujące wyższymi wartościami Ct zostały uznane za <LOD. W przypadku oznaczeniaChr9D, dla kilku próbek dzików uzyskano wartości Ct ≥ 34,61. Aby obniżyć prawdopodobieństwo wyników fałszywie pozytywnych, ustaliliśmy wartość odcięcia Ct dla testuChr9D na 34,00. Do zastosowania assayChr9W i assayChr9D w rutynowych analizach, zalecamy użycie kontroli pozytywnej składającej się z 2% (w/w) DNA świni domowej, 0,2% (w/w) DNA dzika i 97,8% (w/w) DNA spermy śledzia.

Do analizy próbek świni domowej za pomocą assayChr9D, uzyskaliśmy 63 pozytywne i tylko jeden negatywny wynik (Mangalica 1) (Ryc. 6). Od 12 osobników Cinta Senese, analizowaliśmy dwie różne części mięsa, próbkę chudą (z longissimus dorsi) i próbkę podskórnego tłuszczu tylnego (ze schabu) (dane nie pokazane). Wartości Ct uzyskane dla próbek chudych (średnia Ct ± SD 25,24 ± 0,44, n = 48) były bardzo podobne do tych dla próbek podskórnego tłuszczu grzbietowego (26,29 ± 0,35, n = 48). Kiedy analizowaliśmy 30 próbek dzików przy użyciu testuChr9D, 21 nie spowodowało wzrostu sygnału fluorescencji, ale dziewięć osobników (jeden z Austrii, pięć z Niemiec i trzy z USA) zostało zidentyfikowanych jako świnia domowa.

Przy użyciu testuChr9W, większość próbek dzików została przypisana prawidłowo, tylko dla trzech próbek (jedna z Niemiec i dwie z USA) uzyskaliśmy wyniki negatywne. Jednakże, testChr9W doprowadził również do pozytywnych wyników dla niektórych osobników świń domowych, w tym jednego Bentheim Black Pied, trzech Krškopolje i trzech Mangalica. W szczególności trzy świnie Mangalica z Austrii zostały zidentyfikowane jako świnie domowe, podczas gdy trzy osobniki z Niemiec zostały zidentyfikowane jako dziki. W przypadku oznaczeniaChr9, w tym oznaczeniaChr9W i oznaczeniaChr9D, 12 z 94 próbek mięsa dało niejednoznaczne wyniki, ponieważ wzrost sygnału fluorescencji uzyskano przy obu oznaczeniach PCR w czasie rzeczywistym. Ponadto jeden osobnik świni rasy Mangalica został zidentyfikowany jako dzik, a trzy osobniki dzika jako świnia domowa.

W badaniu Beugin i wsp.11 przydatność SNP rs81416363 została przetestowana na „czystych” dzikach upolowanych w parku naturalnym w Wogezach we Francji oraz na ograniczonej liczbie komercyjnych ras świń (Landrace, Large White, Piétrain i Duroc). Dziki okazały się nosicielami allelu G (częstotliwość 100%, brak heterozygotyczności), świnie domowe allelu A (częstotliwość 98%, heterozygotyczność 5%).

Aby dowiedzieć się, dlaczego assayChr9W i assayChr9D doprowadziły do kilku błędnych klasyfikacji i kilku niejednoznacznych wyników, genotypowaliśmy odpowiednie próbki dzików i świń domowych za pomocą analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM). Zastosowaliśmy analizę HRM, ponieważ jest to potężna, czaso- i ekonomicznie opłacalna technika genotypowania SNP18. Znormalizowane krzywe topnienia (Rys. 7A) wskazują, że homozygotyczny genotyp G został znaleziony nie tylko dla próbek dzików, ale także dla próbki Mangalica (próbka 1), dla której wzrost sygnału fluorescencji został uzyskany z assayChr9W, ale nie z assayChr9D. Stwierdzono, że próbki dzików, dla których uzyskano wzrost sygnału fluorescencji przy użyciu testuChr9D, są nosicielami co najmniej jednej kopii allelu A. Cztery osobniki dzików wykazywały genotyp heterozygotyczny, pięć było homozygotycznych dla allelu A. Ponadto u pięciu osobników świni domowej, w tym u trzech osobników Krškopolje ze Słowenii, stwierdzono nosicielstwo zarówno allelu A, jak i G. Tak więc, poprzez genotypowanie HRM mogliśmy zweryfikować, że wyniki uzyskane przy pomocy assayChr9W i assayChr9D były zgodne z odpowiednimi genotypami osobników. Nasze wyniki wskazują jednak, że dwa testy jednopróbkowe ukierunkowane na SNP rs81416363, assayChr9W i assayChr9D, nie pozwalają na jednoznaczną dyskryminację dzika i świni domowej.

Normalizowane krzywe HRM dla (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) na chromosomie 9 dla homozygoty G (dzik), homozygoty A (świnia domowa) i heterozygoty A + G oraz (B) SNP g.299084751 C > T na chromosomie 1 dla homozygoty C (dzik), homozygoty T (świnia domowa) i heterozygoty C + T.

Zgodnie z assayChr1D, wszystkie próbki świń domowych z wyjątkiem trzech zostały sklasyfikowane jako świnia domowa (ryc. 6). Zgodnie z analiząChr9D, wartości Ct uzyskane dla próbek chudego i podskórnego tłuszczu z 12 osobników Cinta Senese były bardzo podobne (średnia Ct ± SD odpowiednio 25,99 ± 0,25 (n = 48) i 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Jednakże za pomocą testuChr1D również pięć z 30 próbek dzików zidentyfikowano jako świnie domowe. Analiza próbek dzików przy użyciu testuChr1W dała tylko jeden wynik negatywny. Jednak również jedna próbka z Mangalicy i sześć osobników z Turopolje doprowadziło do wzrostu sygnału fluorescencji przy użyciu assayChr1W.

W badaniu Fontanesi i wsp.10 SNP g.299084751 C > T był genotypowany poprzez analizę próbek pobranych od 293 świń domowych pięciu ras komercyjnych (Italian Large White, Italian Landrace, Italian Duroc, Belgian Landrace i Piétrain) oraz 201 dzików z Europy Południowo-Centralnej (północne Włochy) i Europy Południowo-Wschodniej (Słowenia i regiony zachodnich Bałkanów). Fontanesi i wsp. stwierdzili, że wszystkie osobniki świń domowych są homozygotyczne dla allelu T. 7,5% osobników dzików było nosicielami co najmniej jednej kopii allelu T, przy czym osobniki z Europy Południowo-Wschodniej występowały częściej (12,2%) niż osobniki z Europy Południowo-Centralnej (3,6%). 11,1% dzików z Europy Południowo-Wschodniej miało heterozygotyczny genotyp C/T.

Gdy genotypowaliśmy osobniki dzików i świń domowych dla SNP g.299084751 C > T za pomocą analizy HRM, wykryliśmy również allel T nie tylko u świń domowych, ale również u niektórych dzików (Fig. 7B). Osobnik dzika z USA wykazywał homozygotyczny genotyp T, podczas gdy osobnik dzika z Dolnej Austrii nosił zarówno allel C jak i T. Większość osobników dzików była jednak homozygotyczna dla allelu C. Wynik ten wskazuje, że wzrost sygnału fluorescencji dla trzech próbek dzików (Niemcy Bad Kissingen i Perleberg oraz Europa) uzyskany za pomocą testuChr1D nie był zgodny z ich genotypem, a zatem był spowodowany reaktywnością krzyżową. Stwierdzono, że większość osobników świń domowych jest homozygotyczna dla allelu T. Jednakże sześć z ośmiu osobników z Turopolje wykazywało heterozygotyczny genotyp C/T, co wyjaśnia, dlaczego wzrost sygnału fluorescencji uzyskano zarówno przy użyciu testuChr1D, jak i testuChr1W. Wysoka częstotliwość występowania heterozygotycznego genotypu C/T u Turopolje, rasy świni domowej z Chorwacji, jest zgodna z najnowszą pracą grupy badawczej Fontanesi. Poprzez genotypowanie 47 osobników Turopolje, częstotliwość występowania alleli T i C wynosiła odpowiednio 0,57 i 0,4319.

Nasze wyniki pokazują, że ani dwa testy jednopróbkowe ukierunkowane na SNP rs81416363 ani test duplex ukierunkowany na SNP g.299084751 C > T same w sobie nie pozwalają na jednoznaczną dyskryminację dzika i świni domowej. Jednakże, biorąc pod uwagę wyniki dwóch testów jednopróbkowych i testu dupleksowego, siła dyskryminacji może być drastycznie zwiększona. Nasze wyniki pokazują, że jeśli dwa testy dla tego samego podgatunku (np. assayChr9D i assayChr1D) prowadzą do identycznej klasyfikacji (w podanym przykładzie świni domowej), a wyniki uzyskane za pomocą dwóch testów dla innych podgatunków (w podanym przykładzie assayChr9W i assayChr1W) są niejednoznaczne, prawdopodobieństwo błędnej klasyfikacji jest niskie, jeśli polega się na wynikach, które są identyczne. Stosując tę strategię, 86 (91.5%) z 94 osobników można było przypisać poprawnie.