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LA PROMESA DE MEJORAR LAS TERAPIAS A TRAVÉS DE ESTUDIOS MOLECULARES DE LA REGULACIÓN DE LA HEMOGLOBINA FETAL

Aunque los enfoques terapéuticos no dirigidos comentados anteriormente han demostrado ser prometedores y tener cierto éxito en la inducción de la HbF en entornos clínicos, una mejor comprensión mecánica de los fundamentos moleculares necesarios para el cambio normal de la hemoglobina fetal a la adulta es muy prometedora para permitir el desarrollo de enfoques más eficaces y específicamente dirigidos a la inducción de la HbF. En las décadas que siguieron a la clonación molecular de los genes de la globina, se identificaron diversos factores de transcripción que desempeñaban un papel en la regulación del gen de la globina (Cantor y Orkin 2002). Esto incluía factores de transcripción como GATA1, KLF1 y SCL/ TAL1. Sin embargo, el estudio del papel de estos factores en la regulación del gen de la globina se vio dificultado por el amplio papel de estos factores en la diferenciación y sus funciones pleiotrópicas como reguladores de la globina y de la regulación del gen eritroide. Ninguno de estos factores parecía ser un regulador específico del cambio de la hemoglobina fetal a la adulta. Tuvieron que pasar casi tres décadas desde la clonación inicial de los genes de la globina antes de que se identificaran los reguladores específicos de este proceso.

Las pistas importantes sobre la identidad de dichos factores surgieron del estudio de la variación genética humana natural. Varios grupos buscaron la base de la variación genética común en los niveles de HbF utilizando estudios de asociación dirigidos y de todo el genoma (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Estos estudios dieron como resultado la identificación de tres loci genómicos que albergaban variantes comunes que influían en los niveles de HbF. Esto incluía una región del cromosoma 2 dentro del gen BCL11A, una región intergénica entre los genes HBS1L y MYB en el cromosoma 6, y variantes dentro del locus de la β-globina en el cromosoma 11. Estudios recientes que han mapeado con mayor precisión estas variantes genéticas sugieren que >50% de la variación en los niveles de HbF puede explicarse por la variación común en estos tres loci (Galarneau et al. 2010). Aunque se cree que los niveles de HbF tienen un componente genético heredable en el rango de ∼80%, es importante tener en cuenta que la variación genética aditiva encontrada a partir de variantes genéticas comunes ignora posibles interacciones genéticas de orden superior que pueden no ser detectadas y, por lo tanto, el grado en que los niveles de HbF están determinados genéticamente queda por explorar en futuros estudios (Zuk et al. 2012).

La observación inicial de variantes asociadas con los niveles de HbF dentro del factor de transcripción de dedos de zinc BCL11A llevó a un estudio inicial que perseguía la hipótesis de que BCL11A podría ser un regulador de la expresión de HbF (Sankaran et al. 2008). Trabajos anteriores habían sugerido que BCL11A era un regulador transcripcional crítico implicado en la linfopoyesis B y la neurogénesis (Sankaran et al. 2010). Los niveles de la proteína BCL11A parecían correlacionarse con la etapa de desarrollo de la expresión, de manera que las células eritroides definitivas del hígado primitivo y fetal que expresaban altos niveles de γ-globina, tenían una expresión baja o ausente de las formas de longitud completa de BCL11A. Este resultado sugería que el producto de este gen actuaba como represor de los genes de γ-globina. Para comprobarlo directamente, se llevó a cabo la supresión de BCL11A utilizando enfoques de ARN de horquilla corta (shRNA) en progenitores eritroides primarios adultos y la expresión de γ-globina pudo ser inducida de forma robusta en dicha supresión. El grado de inducción de la γ-globina parecía estar relacionado con el grado de eliminación de BCL11A. Curiosamente, no parece que se produzcan alteraciones importantes en la eritropoyesis a pesar de la fuerte inducción de γ-globina observada. Estudios posteriores han mostrado resultados similares cuando se elimina la expresión de BCL11A utilizando ARNhc (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Además, se ha demostrado que BCL11A interactúa directamente con la cromatina en el locus de la β-globina humana en células eritroides primarias y que parece actuar como parte de un complejo con el factor de transcripción GATA1 y el complejo de remodelación y represión de la cromatina NuRD (Sankaran et al. 2008). Es interesante que el complejo NuRD contenga las HDACs 1 y 2, que se ha sugerido que son las HDACs críticas necesarias para el silenciamiento de la HbF (Bradner et al. 2010). Además, se ha sugerido que el factor de transcripción SOX6 puede cooperar con BCL11A para ayudar a silenciar los genes de γ-globina en los seres humanos y puede ser esencial para unir el promotor proximal de estos genes de globina (Xu et al. 2010).

Aunque la conmutación de la hemoglobina en modelos de ratón, incluso los que albergan un transgén del locus de β-globina humano, parece divergir de la ontogenia normal de la expresión de la globina que se observa en los seres humanos, se demostró un papel evolutivamente conservado de BCL11A en el silenciamiento y la conmutación del gen de la globina en ratones (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Los ratones que carecen de BCL11A parecen tener una eritropoyesis normal, pero no logran silenciar completamente los genes de globina embrionarios en las células eritroides definitivas y permiten una cierta expresión persistente de γ-globina cuando el locus de β-globina humana intacto está presente. Estos resultados refuerzan la importancia de BCL11A como mediador crítico del cambio de globina en los mamíferos. Aunque este estudio inicial abordó el papel de BCL11A en el proceso de desarrollo del cambio de globina en ratones (Sankaran et al. 2009), un estudio más reciente utilizó la inactivación condicional de BCL11A para demostrar que la inactivación inducible puede dar lugar a extensiones robustas y similares de inducción del gen de la γ-globina como ocurre cuando la inactivación se produce en momentos anteriores (Xu et al. 2011). Además, aunque existe una regulación diferencial de los genes de globina entre los humanos y los ratones, la inactivación de BCL11A demostró ser suficiente para mejorar las características hematológicas y patológicas observadas en modelos de ratón de la enfermedad de células falciformes, proporcionando una importante prueba de principio para la eficacia potencial de dirigirse a BCL11A para inducir la HbF (Xu et al. 2011).

Los mecanismos exactos por los que BCL11A silencia la expresión del gen de la γ-globina siguen sin estar claros. Un estudio reciente sugiere que esto puede ser mediado a través de ambas interacciones con factores de transcripción, como SOX6 que se unen a la cromatina en los promotores proximales de γ-globina, así como a través de las interacciones de largo alcance con una variedad de regiones en todo el grupo de genes de β-globina (Xu et al. 2010). Cuando BCL11A está ausente, la conformación del locus de β-globina cambia de manera que el potenciador aguas arriba conocido como región de control del locus se yuxtapone a los genes de γ-globina activados transcripcionalmente. Un fenómeno similar ocurre cuando las células son tratadas con inhibidores de la HDAC que inducen la expresión del gen de la γ-globina (Bradner et al. 2010). Sin embargo, no está claro si estas alteraciones conformacionales están directamente mediadas por BCL11A o si estas alteraciones se producen de forma secundaria al efecto inductor de HbF de la inhibición de BCL11A (o HDAC). Sin embargo, estos resultados apoyan fuertemente la noción de que BCL11A parece tener un papel directo en el silenciamiento de la expresión de la γ-globina dentro del locus de la β-globina. Mediante el mapeo de una variedad de deleciones dentro del locus de la β-globina humana que da lugar a la δβ-talasemia, con modestos aumentos en la HbF y algún desequilibrio de la cadena de globina presente, o HPFH, con fuertes aumentos en la HbF y la síntesis de la cadena de globina equilibrada, se demostró que una región N3-kb aguas arriba del gen de la δ-globina es necesaria para el silenciamiento de los genes de la γ-globina (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). Curiosamente, esta región alberga sitios de unión para BCL11A, junto con sus socios como GATA1 y HDAC1. Cabe destacar que esta región también ha sido implicada de forma independiente como importante para el silenciamiento de la γ-globina a través de estudios de la deleción de talasemia de Corfú en humanos (Chakalova et al. 2005). Este estudio proporciona una importante visión mecánica sobre cómo BCL11A funciona para silenciar la HbF y refuerza la importancia de las mutaciones humanas naturales para entender este proceso de desarrollo que es único en los humanos (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Dados estos hallazgos, es probable que BCL11A sea una importante diana terapéutica. El hecho de que su inactivación induzca la HbF sin dar lugar a una perturbación importante en la eritropoyesis es muy prometedor, aunque se sabe que tiene efectos importantes en otros linajes como los linfocitos B, lo que subraya la importancia del modelado y el análisis in vivo como parte de los esfuerzos en curso para dirigir BCL11A a la inducción de la HbF. Otros estudios que exploren los mecanismos de acción por los que funciona BCL11A podrían conducir a enfoques mejores y más específicamente dirigidos a la inducción de HbF (Sankaran et al. 2011c). SOX6 también puede ser un objetivo potencialmente prometedor para la inducción de la HbF (Xu et al. 2010), aunque se sabe que es necesario para la eritropoyesis normal (Dumitriu et al. 2006). Sin embargo, se ha informado de un paciente con una alteración heterocigótica de SOX6 que no tenía niveles elevados de HbF, lo que sugiere que el gen SOX6 puede tener un mecanismo de compensación de dosis o que puede haber un umbral particular necesario para reducir la expresión de este gen para tener una inducción robusta de HbF (Sankaran et al. 2011a). Esto sugiere que puede haber limitaciones en la consideración de SOX6 como un objetivo potencial de inducción de HbF.

Después de los estudios iniciales sobre BCL11A, dos estudios sugirieron que la expresión de BCL11A parece estar controlada por el factor de transcripción específico de los eritroides KLF1 utilizando enfoques independientes y complementarios. En un estudio, un ratón con un alelo hipomórfico de KLF1 dio lugar a elevaciones de la expresión de globina embrionaria y los ratones transgénicos con el locus de β-globina humana mostraron una expresión persistente de γ-globina (Zhou et al. 2010). Como resultado, los investigadores probaron si la misma regulación podría ocurrir en las células eritroides humanas primarias y pudieron mostrar una conexión similar utilizando enfoques de ARNhc. Los investigadores demostraron entonces que este efecto se produce a través de los efectos directos de KLF1 en el locus de β-globina, pero también a través de los efectos indirectos mediados por la reducción de la expresión de BCL11A en el knockdown de KLF1. Este hallazgo demostró que KLF1 era un regulador transcripcional positivo directo de la expresión de BCL11A. Un segundo grupo examinó la base genética de una forma no vinculada de HPFH que se sugirió que era el resultado de una mutación sin sentido de KLF1 en esta familia (Borg et al. 2010). Los investigadores pudieron demostrar, utilizando células primarias de estos pacientes y de controles no afectados, que el efecto observado era en parte atribuible a un efecto silenciador de KLF1 sobre BCL11A. Un área de incertidumbre continua está relacionada con los fenotipos humanos observados con varios casos de mutaciones de KLF1. Aunque en el informe inicial, todos los receptores de la mutación con sentido erróneo presentaban elevaciones en la expresión de la HbF, hay que señalar que ésta variaba en realidad entre el 3% y el 19% de los niveles totales de hemoglobina. Además, otros informes de mutaciones heterocigotas de KLF1 en humanos muestran una interrupción concomitante de la eritropoyesis o muestran poco efecto en la expresión de HbF (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Estudios más recientes sugieren que las variantes raras en KLF1 están de hecho asociadas con elevaciones en HbF, pero esto no parece ocurrir consistentemente o en la misma medida incluso con mutaciones similares (Gallienne et al. 2012). La base de esta variación está por determinar y será importante entender mejor los mecanismos por los que KLF1 actúa tanto directa como indirectamente, para afectar a la expresión de HbF. Esto será crítico para cualquier trabajo futuro que intente dirigirse a KLF1 para la inducción de HbF, particularmente si se quieren evitar los efectos adversos de tal inhibición en la diferenciación eritroide. Sin embargo, dada la especificidad de KLF1 dentro del linaje eritroide y si la actividad reguladora del gen de la globina de KLF1 pudiera dirigirse específicamente, aún debería considerarse un candidato para inducir HbF.

Además de las variantes genéticas comunes identificadas en BCL11A asociadas con los niveles de HbF en humanos, los estudios GWAS mostraron que había variantes en el cromosoma 6 intergénico entre los genes HBS1L y MYB que parecen tener un efecto dramático en los niveles de HbF en humanos (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Es importante comprender el mecanismo de acción por el que estas variantes dan lugar a alteraciones en los niveles de HbF, ya que las variantes genéticas en este locus parecen tener un efecto tan grande o quizás mayor sobre la morbilidad clínica en las β-hemoglobinopatías como las variantes en el locus BCL11A (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Curiosamente, esta región contiene una variedad de elementos reguladores que se ha sugerido que tienen un papel importante en la regulación de la expresión de MYB en los progenitores eritroides (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Aunque la sobreexpresión de HBS1L no parece afectar a la expresión de γ-globina en las células eritroleucémicas K562, la sobreexpresión de MYB sí parece afectar al nivel de γ-globina producido en estas células (Jiang et al. 2006). Además, los cultivos de progenitores eritroides primarios de humanos con una mayor expresión de HbF tenían con más frecuencia una menor expresión de MYB (Jiang et al. 2006).

Al dar seguimiento a la clásica observación clínica de que los pacientes con una trisomía del cromosoma 13 tienen un retraso en el cambio de la hemoglobina fetal a la adulta y siguen teniendo una expresión persistente de HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran y Sapp 2012), estudios recientes han proporcionado más pruebas de un papel de MYB en la regulación de la expresión de HbF. Mediante el mapeo fino y la realización de un análisis genómico integrador de los genes en una región del cromosoma 13 implicada como necesaria para la elevación de la HbF observada en pacientes con trisomías parciales del cromosoma 13, se descubrió que había dos pequeñas moléculas de ARN de ∼22 nucleótidos que eran las principales candidatas a llevar a cabo dicha actividad, los microARNs 15a y 16-1 (Sankaran et al. 2011b). La sobreexpresión de estos microRNAs en células eritroides adultas primarias en cultivo dio lugar a aumentos en la producción de γ-globina. Al examinar las dianas de estos microARN, se observó que una de las principales dianas en las células eritroides era el MYB. La supresión directa de MYB en progenitores eritroides primarios adultos dio lugar a un aumento espectacular de la producción de γ-globina (Sankaran et al. 2011b), lo que conecta esta observación histórica de un raro síndrome de aneuploidía humana con los trabajos más recientes que examinan los mecanismos moleculares que regulan los niveles de HbF.

El mecanismo por el que MYB puede actuar para regular los niveles de HbF sigue sin estar claro. Esto puede deberse a un efecto sobre la cinética de la eritropoyesis o, alternativamente, también puede ocurrir como resultado de un efecto directo dentro del locus de la β-globina (Higgs y Wood 2008). Serán necesarios más trabajos para explorar estos mecanismos y son muy prometedores en los intentos de dirigir terapéuticamente esta molécula para la inducción de la HbF. Existe la preocupación de que la focalización de MYB pueda tener efectos secundarios indeseables, especialmente dado el papel pleiotrópico de MYB en la hematopoyesis (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Sin embargo, trabajos recientes sugieren que tales estrategias pueden ser prometedoras, ya que el bloqueo parcial de Myb en ratones tuvo poco efecto en la hematopoyesis normal in vivo, mientras que bloqueó drásticamente la progresión de las leucemias (Zuber et al. 2011a). Por lo tanto, la inhibición parcial de MYB puede ser prometedora como estrategia valiosa para la inducción de HbF. La aditividad de los efectos de las variantes en la región intergénica HBS1L-MYB junto con las variantes en el locus BCL11A (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) sugiere que dirigirse a ambas vías juntas podría producir efectos aún más sólidos que dirigirse a cualquiera de ellas por separado.

Aunque los reguladores de la regulación de la HbF comentados anteriormente se han encontrado a través de estudios genéticos humanos, confirmando así su relevancia in vivo en los seres humanos, también se ha sugerido que una variedad de otras moléculas desempeñan un papel en la regulación del gen de la γ-globina a través de varios estudios que utilizan enfoques de cultivo celular o con modelos de ratón (Tabla 1). Estas moléculas se analizan a continuación. Es importante tener en cuenta que la mayoría de los sistemas experimentales disponibles actualmente para estudiar la regulación del gen de la γ-globina presentan limitaciones. Las células eritroides humanas primarias parecen ser permisivas con la manipulación que permite aumentar la producción de γ-globina, lo que no siempre es relevante en los seres humanos in vivo. Además, muchos de los estímulos que se sabe que inducen la producción de γ-globina in vivo en humanos, incluyendo varios tipos de eritropoyesis de estrés y el tratamiento con hidroxiurea, no funcionan para inducir la producción de γ-globina en modelos de ratones humanizados (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009) subrayando una importante limitación para interpretar los hallazgos negativos en este sistema experimental. Por lo tanto, es necesario tener precaución al interpretar los hallazgos experimentales que no estén respaldados por pruebas de estudios genéticos humanos o estudios realizados en humanos o primates in vivo.

Al examinar las proteínas que se unen a los elementos de repetición directa que se encuentran dentro del promotor de los genes de γ-globina, se ha sugerido que los receptores huérfanos de hormonas nucleares TR2 y TR4 desempeñan un papel como represores de la expresión de los genes de γ-globina (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradójicamente, la sobreexpresión de TR2 y TR4 en modelos de ratones transgénicos resulta en una elevada expresión de γ-globina y cuando se sobreexpresa en modelos de ratones con enfermedad de células falciformes puede resultar en una mejora parcial de los síntomas hematológicos y patológicos de estos ratones (Campbell et al. 2011). Los mecanismos subyacentes a estas observaciones y la relevancia para la regulación del gen de la globina en humanos aún no se han establecido para TR2 y TR4. Además, se ha sugerido que el receptor nuclear de la hormona nuclear huérfana COUP-TFII también se une a las repeticiones directas y reprime el promotor de la γ-globina en humanos (Filipe et al. 1999). Utilizando cultivos in vitro de células eritroides adultas primarias, se demostró que citoquinas como el SCF parecen regular a la baja la expresión y la ocupación de la cromatina de COUP-TFII en el locus de la β-globina, lo que resulta en un aumento de la expresión de la γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Además, la regulación directa a la baja de COUP-TFII mediante pequeños ARN de interferencia (siRNA) podría dar lugar a un aumento de la producción de γ-globina (Aerbajinai et al. 2009). Serán necesarios más estudios sobre el papel de COUP-TF en la regulación de la HbF para comprender mejor su papel fisiológico en los seres humanos.

Estudios recientes también han sugerido un papel para el gen llamado amigo de PRMT1 (FOP1) en la represión de la expresión del gen de la γ-globina (van Dijk et al. 2010). La supresión de FOP1 da lugar a una elevada expresión de HbF en células eritroides humanas adultas en cultivo. Se sugirió que esto estaba mediado por la reducción de la expresión de SOX6, cuya eliminación se sabe que también resulta en un aumento de la producción de γ-globina (Xu et al. 2010). Serán necesarios más trabajos para confirmar estos hallazgos, entender si este gen también tiene un papel en la eritropoyesis de forma más amplia, y examinar el mecanismo que subyace a estas observaciones.

Algunos estudios también han sugerido un papel para la proteína selectora de etapas NF-E4 como activador de la expresión de γ-globina en los seres humanos (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Se ha sugerido que una forma corta de NF-E4 puede tener un papel en la represión de los genes de γ-globina al inhibir la función activadora normal de NF-E4 en el promotor de estos genes (Zhou et al. 2004). Todos estos estudios se han basado en experimentos realizados en células cultivadas y en la purificación bioquímica de los complejos proteicos de las células K562, por lo que serán necesarios más trabajos para confirmar el papel fisiológico de este gen en la expresión de la γ-globina y comprender mejor los mecanismos a través de los cuales este complejo puede estar actuando para alterar la regulación del gen de la globina humana.