Diferenciação entre javali e porco doméstico na alimentação, visando dois loci genes por PCR em tempo real

Desenho de primário e sonda

Para o desenho de primário e sonda, selecionamos polimorfismos que já haviam sido relatados para permitir a discriminação de javali e porco doméstico. Começamos com o SNP g.299084751 C > T no gene NR6A1, que foi encontrado associado ao número de vértebras torácicas e lombares: javalis, que são homozigotos para o alelo tipo selvagem g.299084751 C, têm 19 vértebras, enquanto porcos domésticos, que são homozigotos para g.299084751 T, têm 21-23 vértebras. No estudo de Fontanesi et al., este SNP foi usado para discriminar javalis e porcos domésticos por PCR-RFLP10. O objectivo foi desenhar um par de primer para amplificação da região alvo tanto em javalis como em porcos domésticos, e duas sondas TaqMan, específicas para o alelo do javali (g.299084751 C) e o alelo do porco doméstico (g.299084751 T), respectivamente. O ensaio duplex deve permitir detectar javalis e porcos domésticos simultaneamente num único e mesmo poço. No total, desenhámos quatro primários para a frente, três primários para trás, quatro sondas para javalis e uma sonda para porcos domésticos e combinámo-los em 21 sistemas de primários/sondas (Chr1a – u, Tabela Complementar 1). O sistema de iniciadores/sondas Chr1a visou o cordão superior, o sistema de iniciadores/sondas Chr1b-u o cordão inferior do gene NR6A1. Em uma série de experimentos, investigamos se os sistemas de primer/sonda eram específicos para javalis ou apresentavam atividade cruzada com raças/cruzamentos de porcos domésticos. O sistema de iniciadores/sondas Chr1a resultou num valor ΔCt ≥ 10,56 entre porco doméstico e javali (Tabela Complementar 2). Para o Chr1i – o, ΔCt os valores variaram de 8,65 a 11,19. Os sistemas de iniciadores/sondas Chr1b – h e Chr1p – t não resultaram num aumento do sinal de fluorescência para as raças de porcos domésticos/cruzamentos cruzados. Como o sistema de iniciador/sonda Chr1q resultou no menor valor de Ct (24,77; n = 2) para javalis, testamos sua aplicabilidade em combinação com uma sonda TaqMan para suínos domésticos no formato de ensaio duplex (sistema de iniciador/sonda Chr1u, Tabela Suplementar 1). Como os valores de Ct tanto para javalis (26,21, n = 2) como para porcos domésticos (27,90, n = 2) foram satisfatórios, todos os outros experimentos de PCR visando SNP g.299084751 C > T foram realizados com primer/sistema de sonda Chr1u. No seguinte, o ensaio de PCR duplex em tempo real chama-se ensaioChr1, que consiste no ensaio para porco doméstico, ensaioChr1D, envolvendo o primer Chr1f4, primer invertido Chr1r2 e sonda Chr1p1D, e o ensaio para javali, ensaioChr1W, envolvendo o primer Chr1f4, primer invertido Chr1r2 e sonda Chr1p4W (Fig. 1A).

Sequências parciais do gene (A) NR6A1 no cromossoma 1 portador de SNP g.299084751 C > T, alvo pelo ensaio duplex “assayChr1”, e (B) cromossoma 9 carregando o SNP g.118314929 A > G (rs81416363), alvo pelos dois ensaios singleplex “assayChr9D” e “assayChr9W”. As setas indicam as posições dos iniciadores (cinza escuro) e das sondas (cinza claro). (A) O ensaio DuplexChr1 incluiu primário frontal Chr1f4, primário inverso Chr1r2, sonda Chr1p4W e sonda Chr1p1D. (B) Ensaio SingleplexChr9D incluído primer Chr9f8, primer inverso Chr9r17D e sonda Chr9p2; ensaio SingleplexChr9W incluído primer Chr9f8, primer inverso Chr9r12W e sonda Chr9p2. As bases subespécies específicas são mostradas em negrito (setas vermelhas verticais) e as bases de descasamento em azul (setas azuis verticais).

Desde que aprendemos com a literatura que o poder de discriminação ao visar apenas um polimorfismo não é muito provavelmente suficiente, procuramos por um locus gênico mais adequado. Ao investigar 20 SNPs para sua aplicabilidade na diferenciação entre javali e porco doméstico, Beugin et al. encontraram os SNPs rs80864596 (intergênico, cromossomo 5), rs80796712 (glicogênio sintetase quinase 3-beta, cromossomo 13) e rs81416363 (intergênico, cromossomo 9) para mostrar o maior poder de discriminação11. Portanto, selecionamos esses três SNPs para projetar os sistemas de primer/probe. Em comparação com o projeto de primer/probe para SNP g.299084751 C > T, nós seguimos uma estratégia diferente. Ao invés de localizar a base específica da subespécie na sonda, nós a localizamos no penúltimo site do 5′ final do primer forward ou do primer reverse. A fim de melhorar a especificidade, introduzimos desajustes deliberados de base. Esta técnica chamada de ensaio de mutação de amplificação de má combinação (MAMA)12,13 tem a vantagem de ser bastante eficiente em termos de custo, pois uma mesma sonda pode ser testada com uma série de primers que diferem na posição de má combinação. Na primeira série de experimentos, introduzimos a base de descasamento na 3ª ou 6ª posição a partir do final do primer 3′ com a base específica da subespécie. Quando tínhamos desenvolvido ensaios PCR em tempo real para veados vermelhos, gamos e veados sika, respectivamente14,15,16, esta estratégia tinha-se revelado um sucesso. No entanto, no presente estudo nenhum dos sistemas de primer/probe (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Tabela Complementar 1) permitiu a diferenciação entre porco doméstico e javali (Tabela Complementar 3). Os melhores resultados (ΔCt valor entre as raças de porcos domésticos/cruzados e javalis ≥5.24) foram obtidos com o sistema de primário/sonda Chr9j. Neste sistema primer/probe, visando o SNP rs81416363 no cromossoma 9, a base de descoordenação foi localizada na 3ª posição a partir do final do primer 3′ (TTCACG → TTCCCG). A fim de aumentar a especificidade, introduzimos um novo descasamento na 4ª posição (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) ou 5ª posição (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) a partir do final do primer 3′. A introdução de desajustes adicionais revelou-se um sucesso. Com o sistema de primário/sonda Chr9r (Tabela suplementar 1) obtivemos tanto o menor valor Ct para javalis (22,09; n = 2) como o maior valor ΔCt (10,52) entre as raças de porcos domésticos/cruzados e javalis (Tabela suplementar 3). Este ensaio de PCR em tempo real para javalis, visando o SNP rs81416363 localizado no cromossoma 9, foi baseado no sistema primer/probe Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Next, aplicamos a estratégia MAMA para desenvolver o ensaio de PCR em tempo real correspondente, visando o SNP rs81416363 localizado no cromossoma 9, para porcos domésticos. Localizámos a base específica de porco doméstico na penúltima base a partir do final do primer 5′ e a base de desadequação na 3ª posição a partir do final do 3′ (primer/probe sistemas Chr9v – x; Tabela Complementar 1). No entanto, a introdução de uma base de descasamento não foi suficiente para permitir a diferenciação de porco doméstico e javali. A introdução de bases de descasamento na 3ª e 5ª posições a partir da extremidade 3′ do iniciador (sistemas de iniciadores/sondas Chr9y – ag) levou a um valor ΔCt ≥ 4.83. Quando os desajustes estavam nas posições 3 e 4 (sistemas de iniciador/sonda Chr9ah – aj), o valor ΔCt era ≥5.85. Introduzindo três bases de desencontros consecutivos ao lado da base específica da subespécie (sistemas de iniciadores/sondas Chr9ak – am), a especificidade poderia ser aumentada. O sistema Chr9ak, no qual os desajustes estavam nas posições 3, 4 e 5 (TTCATG → TGGTTG) levou ao valor mais alto ΔCt de ≥9.97. Assim, todas as outras experiências foram realizadas com o sistema de primário/sistema de sondas Chr9ak. A seguir, os dois ensaios singleplex que visam o SNP rs81416363 no cromossoma 9 são referidos como ensaioChr9D, incluindo o iniciador frontal Chr9f8, o iniciador invertido Chr9r17D e a sonda Chr9p2, e o ensaioChr9W, incluindo o iniciador frontal Chr9f8, o iniciador invertido Chr9r12W e a sonda Chr9p2 (Fig. 1B).

Optimização da concentração de primer/sonda e relação

Todos os resultados apresentados acima foram obtidos com concentrações de primer e sonda de 500 nM e 200 nM (sistemas de primer/sonda visando os cromossomos 1), e 200 nM e 100 nM (sistemas de primer/sonda visando os cromossomos 5, 9 e 13), respectivamente. Em seguida, investigamos se a especificidade dos ensaios de PCR em tempo real poderia ser aumentada através da otimização da concentração e da relação primer/probe. No caso do ensaioChr1, as concentrações ideais de iniciador e sonda foram encontradas em 1.000 nM e 200 nM, respectivamente (Tabela Suplementar 4). No caso do ensaioChr9W e do ensaioChr9D, um excedente do primer contendo tanto a base específica da subespécie como as bases de não correspondência resultou em valores superiores ΔCt entre a subespécie de reacção cruzada e a espécie alvo. A maior seletividade do ensaioChr9W e do ensaioChr9D foi alcançada com concentrações de primer para frente/primer inverso/ sonda de 12,5/200/50 nM e 62,5/800/50 nM, respectivamente.

Testes de reatividade cruzada

Próximo, realizamos testes de reatividade cruzada com isolados de DNA de javalis, várias raças de porcos domésticos/cruzados e outras 22 espécies animais listadas na Tabela Complementar 5. A Figura 2A-D mostra as curvas de amplificação obtidas com o ensaioChr9W, ensaioChr9D, ensaioChr1W e ensaioChr1D, respectivamente. O ensaioChr9W mostrou leve reatividade cruzada com porcos domésticos, veados sika, ibex alpino, ovelhas, cabras e camurças (ΔCt ≥ 12.10, n = 2), ensaioChr9D com javalis, veados sika, alces, cavalos e perus (ΔCt ≥ 8.41, n = 4). Ao contrário dos ensaios que visam o SNP rs81416363 no cromossoma 9, o assayChr1 não mostrou qualquer reactividade cruzada (com a excepção do assayChr1W para veados em apenas uma em cada quatro réplicas). Também analisamos isolados de DNA de 50 espécies de plantas comumente usadas como ingredientes alimentares (Tabela Complementar 6). Nenhum dos ensaios mostrou reactividade cruzada com qualquer das espécies vegetais.

Resultados obtidos através da realização de testes de reactividade cruzada com isolados de ADN (10 ng/µL) de 22 espécies animais e javalis/suínos domésticos. (A) ensaioChr9W, (B) ensaioChr9D, (C) ensaioChr1W e (D) ensaioChr1D.

>

Processamento de vários master mixes comerciais para a sua aplicabilidade

Numa próxima série de experiências, investigámos se o tipo do master mix comercial influenciou a selectividade dos ensaios. Analisamos o DNA isolado de 23 espécies animais incluindo 3 indivíduos de javalis e 11 raças/cruzamentos de porcos domésticos com um total de cinco master mixes de diferentes fornecedores. As master mixes e os respectivos programas de temperatura são apresentados na Tabela Complementar 7. Em geral, o tipo de master mix influenciou tanto os valores absolutos Ct como os valores ΔCt entre as (sub)espécies alvo e as (sub)espécies cruzadas. No entanto, os ensaios de PCR em tempo real foram influenciados de forma diferente. No caso do ensaioChr9W, por exemplo, a mistura 2 e 3 resultou em valores de Ct superiores aos da master mix 1 (a master mix padrão no presente estudo), 4 e 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). No caso do ensaioChr9D, o tipo de master mix teve influência nos valores de ΔCt e, portanto, na seletividade do ensaio. Os valores de ΔCt obtidos com master mix 1, 2, 3 e 4 foram ≥ 8.41, ≥ 10.40, ≥ 7.18 e ≥ 5.86, respectivamente, enquanto que com master mix 5, não foi observada nenhuma reactividade cruzada. No caso do assayChr1, valores Ct bastante semelhantes foram obtidos com master mix 1, 3 e 4. No entanto, a master mix 2 e 5 não resultou na formação de nenhum produto, muito provavelmente porque estas misturas não são adequadas para a multiplexação. Com base nestes resultados, recomendamos vivamente que se teste a aplicabilidade caso se pretenda utilizar outro tipo de master mix.

Robustness

A robustez dos ensaios de PCRs em tempo real foi investigada variando a temperatura de recozimento ±1 °C e o volume da mistura de reacção por poço em ±5% e aplicando dois diferentes ciclos de PCR em tempo real. Os experimentos foram realizados com isolados de DNA de javali, porco doméstico e ovas de cervo. Para o ensaioChr9W e o ensaioChr9D, os valores Ct foram muito semelhantes aos obtidos sob condições padrão (ΔCt valores <1,00) excepto quando a temperatura de recozimento foi aumentada para 61 °C (ΔCt valores ≤2,16 e ≤1,57, respectivamente). Com ΔCt valores ≤0.77, o assayChr1 revelou-se ainda mais robusto. Nem a redução do volume total da reacção nem a utilização de outro ciclo de PCR em tempo real influenciaram substancialmente os valores Ct, demonstrando a robustez dos ensaios de PCR em tempo real.

Intervalo de trabalho, alcance linear e eficiência de amplificação

Analizando um isolado de ADN de javali (211 µg/mL) e dois isolados de ADN de porco doméstico (158 µg/mL e 160 µg/mL) diluídos em série em água (1:2-1:524,288), assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W e assayChr1D foram lineares entre 211 µg/mL e 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL e 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL e 6 ng/mL (R2 = 0,9994) e 160 µg/mL e 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivamente (Fig. 3A). As eficiências de amplificação calculadas a partir das inclinações das curvas padrão foram de 83%, 96%, 93% e 95%, respectivamente. Além disso, o intervalo de linearidade foi avaliado através da análise de ADN de javali e de suínos domésticos isolados em série diluídos em ADN de esperma de arenque. Para o ensaioChr9W e ensaioChr9D, a linearidade variou de 20 µg/mL a 20 ng/mL (R2 = 0,9988) e 20 µg/mL a 39 ng/mL (R2 = 0,9985), respectivamente (Fig. 3B). No caso do ensaioChr1W e do ensaioChr1D, a linearidade estava na faixa de 20 µg/mL a 5 ng/mL (R2 = 0,9978) e 20 µg/mL a 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivamente. As eficiências de amplificação calculadas a partir das inclinações das curvas padrão foram 76%, 90%, 97% e 101%, respectivamente.

Intervalo de linearidade dos quatro ensaios, (A) determinado em água como fundo e (B) determinado em ADN de esperma de arenque como ADN de fundo não alvo.

Estes resultados indicam que o intervalo de trabalho dos ensaios PCR em tempo real é quase idêntico, enquanto que o intervalo de linearidade é mais estreito para os ensaios que visam o cromossoma 9 do que para os que visam o cromossoma 1. Todas as eficiências de amplificação foram entre 90% e 110%, como recomendado pelas directrizes ENGL17 , excepto no ensaioChr9W (83% em água, 76% em ADN de esperma de arenque). A menor eficiência de amplificação do ensaioChr9W é muito provavelmente causada pela diminuição da estabilidade de ligação do primer devido aos desajustes, introduzidos para aumentar a selectividade para as espécies animais alvo.

Limite de detecção (LOD) no DNA do esperma do arenque e DNA do porco como DNA de fundo

O LOD foi definido como a menor concentração de DNA que resultou num aumento do sinal de fluorescência em pelo menos 19 de 20 réplicas. Além disso, o valor Ct deve ser inferior ao valor Ct obtido para espécies de reacção cruzada.

No DNA do esperma do arenque, o LOD do ensaioChr9D (1,0%, p/p, Fig. 4A) foi ligeiramente maior que o LOD dos outros três ensaios (0,2%, p/p, Fig. 4B-D). O maior LOD do ensaioChr9D é causado pela reactividade cruzada com javalis (ΔCt valor entre javalis e porcos domésticos apenas ≥8.41).

>

Determinação do LOD através da análise de diluições em série de ADN (A-D) contendo ADN de javali ou de porco doméstico no ADN do esperma do arenque e (E-H) uma mistura de ADN de javali no ADN do porco doméstico ou ADN de porco doméstico no ADN do javali como ADN de fundo. (A,E) foram obtidas usando o ensaioChr9D, (B,F) usando o ensaioChr9W, (C,G) usando o ensaioChr1D e (D,H) usando o ensaioChr1W. As medições foram realizadas em 20 réplicas. Os círculos representam valores Ct individuais, linhas horizontais indicam os valores médios.

Além disso, determinamos o LOD dos ensaios de PCR em tempo real para javali, ensaioChr1W e ensaioChr9W, em ADN de porco doméstico como fundo, e o dos ensaios para porco doméstico, ensaioChr1D e ensaioChr9D, em ADN de javali como fundo. Com 2%, 0,2%, 5% e 2% (p/p), os LODs do ensaioChr9D (Fig. 4E), do ensaioChr9W (Fig. 4F), do ensaioChr1D (Fig. 4G) e do ensaioChr1W (Fig. 4H) foram bastante diferentes. O LOD mais elevado do assayChr1D na presença de ADN de javali foi causado pela supressão do sinal, muito provavelmente devido à competição das duas sondas para a sequência alvo no formato de ensaio duplex. Para investigar a supressão do sinal com mais detalhe, foram analisadas misturas de ADN contendo 25% (p/p) de ADN de javali no ADN de porco doméstico ou 25% (p/p) de ADN de porco doméstico no ADN de javali, para além dos controlos positivos (ADN de javali e ADN de porco doméstico, respectivamente).

Quando comparamos os controles positivos com os padrões 1:4 diluídos contendo DNA não-alvo, não encontramos diferença nas curvas de amplificação (valores ΔRn) para o ensaioChr9W e ensaioChr9D (Fig. 5A,B). Entretanto, no caso do ensaioChr1W e ensaioChr1D, os sinais fluorescentes (valores ΔRn) obtidos para o controle positivo foram superiores aos obtidos para o padrão diluído 1:4 com a mesma concentração de DNA alvo (Fig. 5C,D).

Curvas de amplificação (em visão semi-lógica) obtidas para misturas de DNA (20 ng/µL) contendo 25% (p/p) da subespécie alvo (javali ou porco doméstico) e 75% (p/p) da subespécie não alvo (javali ou porco doméstico) e suas diluições em série (1:4 a 1:1,024). Como controles foram utilizados isolados de DNA (5 ng/µL) de javali e porco doméstico, respectivamente. O ensaioChr9W (A) e o ensaioChr9D (B) mostram reactividade cruzada com a subespécie não alvo. O ensaioChr1W (C) e o ensaioChr1D (D) mostram supressão de sinal na presença da subespécie não alvo.

Repetibilidade

A repetibilidade dos ensaios de PCR em tempo real foi investigada através da análise de misturas de extracto de carne contendo 30% (p/p) de ADN alvo e 70% (p/p) de ADN não alvo da subespécie, bem como diluições em série, em duplicados cinco vezes em quatro dias diferentes. Os valores RSD dos Ct foram ≤1,0% (ensaioChr1W), ≤1,9% (ensaioChr9W), ≤2,3% (ensaioChr1D) e ≤3,5% (ensaioChr9D), demonstrando a elevada repetibilidade dos ensaios.

Análise de amostras de javalis e suínos domésticos

Os ensaios de PCR em tempo real foram aplicados à análise de amostras de 64 indivíduos de suínos domésticos, incluindo 14 raças e 6 cruzamentos (Fig. 6A). Além disso, analisámos um total de 30 amostras de javalis de 5 países diferentes (Áustria, Estónia, Alemanha, Roménia e EUA, Fig. 6B). No caso de um indivíduo de javali da Europa, a origem exacta era desconhecida. Cada amostra foi analisada em pelo menos quatro réplicas. A cada placa PCR foi adicionado um controlo positivo (mistura de ADN, 10 ng/µL), contendo a subespécie alvo na mesma concentração que o LOD, fornecendo o valor Ct de corte.

Resultados obtidos para (A) 64 amostras de porcos domésticos e (B) 30 amostras de javalis. As medições foram realizadas em pelo menos quatro réplicas.

Quando analisamos os controles positivos em 14 réplicas, a média ± DP dos valores Ct foi 33,85 ± 0,93 (ensaioChr9W), 35,19 ± 1,11 (ensaioChr9D), 32,89 ± 0,28 (ensaioChr1W) e 32,60 ± 0,47 (ensaioChr1D). Com exceção do ensaioChr9D, todas as amostras que resultaram em valores Ct maiores foram consideradas <LOD. No caso do ensaioChr9D, para várias amostras de javali foram obtidos valores Ct ≥ 34,61. Para diminuir a probabilidade de resultados falsos positivos, definimos o valor Ct de corte do ensaioChr9D em 34,00. Para a aplicação do ensaioChr9W e do ensaioChr9D na análise de rotina, recomendamos a utilização de um controlo positivo composto por 2% (p/p) de ADN de porco doméstico, 0,2% (p/p) de ADN de javali e 97,8% (p/p) de ADN de esperma de arenque.

Para a análise de amostras de porco doméstico com o ensaioChr9D, obtivemos 63 resultados positivos e apenas um negativo (Mangalica 1) (Fig. 6). Dos 12 indivíduos Cinta Senese, analisamos duas partes diferentes de carne, uma amostra magra (de longissimus dorsi) e uma amostra subcutânea de gordura dorsal (de lombo) (dados não mostrados). Os valores de Ct obtidos para amostras magras (média Ct ± SD de 25,24 ± 0,44, n = 48) foram muito semelhantes aos das amostras de gordura lombar subcutânea (26,29 ± 0,35, n = 48). Quando analisamos as 30 amostras de javalis com o ensaioChr9D, 21 não resultaram num aumento do sinal de fluorescência, mas nove indivíduos (um da Áustria, cinco da Alemanha e três dos EUA) foram identificados como porcos domésticos.

Com o ensaioChr9W, a maioria das amostras de javalis foi atribuída correctamente, apenas para três amostras (uma da Alemanha e duas dos EUA) obtivemos resultados negativos. No entanto, o ensaioChr9W também levou a resultados positivos para alguns indivíduos de porcos domésticos, incluindo um Bentheim Black Pied, três Krškopolje e três porcos Mangalica. Notavelmente, os três porcos Mangalica da Áustria foram identificados como porcos domésticos, enquanto os três indivíduos da Alemanha foram identificados como javalis. No caso do ensaioChr9, incluindo o ensaioChr9W e o ensaioChr9D, 12 das 94 amostras de carne conduziram a resultados ambíguos, porque foi obtido um aumento no sinal de fluorescência com ambos os ensaios de PCR em tempo real. Além disso, um indivíduo de porco Mangalica foi identificado como javali e três indivíduos de javali como porco doméstico.

No estudo de Beugin et al.11 a adequação do SNP rs81416363 tinha sido testada em javalis “puros” caçados num parque natural nos Vosges em França e num número limitado de raças de porcos comerciais (Landrace, Large White, Piétrain e Duroc). Foram encontrados javalis selvagens portadores do alelo G (frequência 100%, sem heterozigosidade), porcos domésticos do alelo A (frequência 98%, heterozigosidade 5%).

Para descobrir porque é que o ensaioChr9W e o ensaioChr9D levaram a várias classificações erradas e a alguns resultados ambíguos, genotipámos as respectivas amostras de javalis e porcos domésticos através da análise de fusão de alta resolução (HRM). Aplicamos a análise HRM porque é uma técnica poderosa, eficiente em termos de tempo e custo para a genotipagem do SNP18. As curvas de fusão normalizadas (Fig. 7A) indicam que o genótipo homozigoto G não foi encontrado apenas para amostras de javalis, mas também para a amostra Mangalica (amostra 1) para a qual foi obtido um aumento no sinal de fluorescência com o ensaioChr9W, mas não com o ensaioChr9D. Amostras de javalis resultando num aumento no sinal de fluorescência com o ensaioChr9D foram encontradas a transportar pelo menos uma cópia do alelo A. Quatro indivíduos de javali mostraram o genótipo heterozigótico, cinco eram homozigotos para o alelo A. Além disso, cinco indivíduos de porcos domésticos, incluindo três indivíduos de Krškopolje da Eslovénia, foram encontrados a transportar tanto o alelo A como o alelo G. Assim, através da genotipagem HRM foi possível verificar que os resultados obtidos com o ensaioChr9W e o ensaioChr9D estavam de acordo com os respectivos genótipos dos indivíduos. Entretanto, nossos resultados indicam que os dois ensaios singleplex, visando o SNP rs81416363, assayChr9W e assayChr9D, não permitem a discriminação inequívoca de javali e porco doméstico.

Curvas normalizadas de MFC para (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) no cromossoma 9 para homozigoto G (javali), homozigoto A (porco doméstico) e heterozigoto A + G e (B) SNP g.299084751 C > T no cromossoma 1 para homozigoto C (javali), homozigoto T (porco doméstico) e heterozigoto C + T.

Com o ensaioChr1D, todas as amostras de porcos domésticos, excepto três, foram classificadas como porcos domésticos (Fig. 6). De acordo com o ensaioChr9D, os valores Ct obtidos para as amostras de gordura magra e subcutânea lombar dos 12 indivíduos Cinta Senese foram muito semelhantes (média Ct ± SD de 25,99 ± 0,25 (n = 48) e 26,36 ± 0,25 (n = 48), respectivamente). No entanto, com o ensaioChr1D também cinco das 30 amostras de javalis foram identificadas como sendo de suínos domésticos. A análise das amostras de javalis com o ensaioChr1W levou a apenas um resultado negativo. Entretanto, também uma amostra de Mangalica e seis indivíduos de Turopolje levaram a um aumento no sinal de fluorescência com o ensaioChr1W.

No estudo de Fontanesi et al.10 o SNP g.299084751 C > T tinha sido genotipado analisando amostras de 293 porcos domésticos de cinco raças comerciais (Large White Italiana, Landrace Italiana, Duroc Italiana, Landrace Belga e Piétrain) e 201 javalis do Sul da Europa Central (Norte de Itália) e Sudeste da Europa (Eslovénia e regiões dos Balcãs Ocidentais). Fontanesi et al. encontraram todos os indivíduos de porcos domésticos como sendo homozigotos para o alelo T. 7,5% dos indivíduos de javalis transportaram pelo menos uma cópia do alelo T, sendo os indivíduos do Sudeste da Europa mais frequentes (12,2%) do que os indivíduos do Sul da Europa Central (3,6%). 11,1% dos javalis do Sudeste da Europa eram do genótipo heterozigoto C/T.

Quando genotipamos os indivíduos de javalis e porcos domésticos para SNP g.299084751 C > T pela análise HRM, também detectamos o alelo T não só em porcos domésticos mas também em alguns javalis (Fig. 7B). O indivíduo javali dos EUA mostrou o genótipo T homozigoto, enquanto que o indivíduo javali da Baixa Áustria carregava tanto o alelo C como o alelo T. A maioria dos javalis era, no entanto, homozigotos para o alelo C. Este resultado indica que o aumento do sinal fluorescente para três amostras de javali (Alemanha Bad Kissingen e Perleberg, e Europa) obtido com o ensaioChr1D não estava de acordo com o seu genótipo e portanto causado por reactividade cruzada. A maioria dos indivíduos de suínos domésticos foi encontrada como sendo homozigotos para o alelo T. Entretanto, seis dos oito indivíduos de Turopolje foram encontrados para mostrar o genótipo heterozigoto C/T, explicando porque um aumento no sinal de fluorescência foi obtido tanto com o ensaioChr1D como com o ensaioChr1W. A alta frequência do genótipo heterozigoto C/T em Turopolje, uma raça de porcos domésticos da Croácia, está de acordo com um trabalho muito recente do grupo de pesquisa do Fontanesi. Através da genotipagem de 47 indivíduos de Turopolje, a frequência dos alelos T e C foram relatados como sendo de 0,57 e 0,43, respectivamente19,

Os nossos resultados demonstram que nem os dois ensaios singleplex que visam o SNP rs81416363 nem o ensaio duplex que visa o SNP g.299084751 C > T permitem por si só a discriminação inequívoca dos javalis e porcos domésticos. Contudo, tomando em consideração os resultados dos dois ensaios singleplex e do ensaio duplex, o poder de discriminação pode ser drasticamente aumentado. Os nossos resultados demonstram que se os dois ensaios para a mesma subespécie (por exemplo o ensaioChr9D e o ensaioChr1D) levarem à classificação idêntica (no exemplo dado porco doméstico), e os resultados obtidos com os dois ensaios para a outra subespécie (no exemplo dado o ensaioChr9W e o ensaioChr1W) forem ambíguos, a probabilidade de classificação errada é baixa se nos basearmos nos resultados que são idênticos. Seguindo esta estratégia, 86 (91,5%) de 94 indivíduos poderiam ser atribuídos corretamente.