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Embora a maioria das enzimas de restrição tipo II sejam homodímeros que interagem com uma cópia do seu local de reconhecimento palíndromo, existem subtipos que requerem a cooperação de dois locais (revisto em Pingoud e Jeltsch, 1997). Como apontado por S. Halford (Bristol, UK), este é o caso não só para enzimas tipo IIe, como NaeI, mas também para enzimas tipo IIf, como SfiI, e enzimas tipo IIS, como FokI. Tipo IIf enzimas são homotetramers com dois locais de ligação de DNA separados, cada um formado por duas subunidades. A SfiI só está ativa quando ambos os locais de ligação de DNA estão ocupados, levando a uma clivagem simultânea de ambos os locais. Para FokI, que consiste de uma clivagem e um domínio de reconhecimento, foi mostrado anteriormente que a dimerização da enzima no DNA é necessária para que a clivagem ocorra. A Halford mostrou agora que dois locais de reconhecimento são necessários para uma clivagem eficiente, porque cada um dos domínios de reconhecimento deve interagir com uma sequência de reconhecimento. Todos os três tipos de enzimas agem de forma otimizada com dois locais no mesmo DNA, onde eles prendem o DNA entre os locais em um loop.

Atypical type II restriction enzymes continue a ser descoberto. O BbvCI é uma enzima de restrição heterodimérica que reconhece uma sequência assimétrica. As subunidades são inativas individualmente, mas ativas em conjunto. Isto torna possível a criação de enzimas de nicking específicas através da inativação de uma subunidade usando a mutagênese dirigida ao local, como foi relatado por G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Lituânia) obteve um resultado semelhante para a enzima de restrição heterodimérica Bpu10I. Ele também conseguiu relaxar a especificidade do substrato de Eco57I, uma enzima monomérica de restrição e modificação, que tem um único domínio de reconhecimento de alvo. Neste estudo, foi utilizada a mutagênese aleatória para gerar uma variante que interage não só com o sítio do CTGAAG canônico, mas também com os sítios do CTGGAG. A base molecular desta especificidade relaxada ainda não foi determinada. V. Siksnys (Vilnius, Lituânia) relatou a descoberta de uma nova enzima de restrição do tipo IIs, BfiI, que não depende de íons metálicos divalentes para clivagem. Esta enzima mostra seqüência similar a um nuclease não específico de Salmonella typhimurium e presumivelmente usa um mecanismo catalítico similar.

A. Pingoud (Giessen, Alemanha) discutiu o mecanismo de clivagem do DNA por enzimas de restrição do tipo II e endonucleases de homing, que compartilham uma função comum, mas em geral têm estruturas diferentes e presumivelmente seguem diferentes mecanismos de clivagem. Apesar da informação detalhada da estrutura estar disponível para muitas enzimas de restrição que compartilham um motivo catalítico comum, não há consenso sobre o mecanismo catalítico ou o número de íons Mg2+ que estão envolvidos na catálise. Em princípio, o mesmo é válido para outras transferências de fósforo com um centro catalítico semelhante a uma enzima de restrição. Exemplos de tais proteínas são a enzima de reparação Vsr (E. coli) e a Hjc resolvase (Pyrococcus furiosus). A estrutura cristalina desta última foi apresentada por K. Morikawa (Osaka, Japão) (Figura (Figura3).3). Em contraste, o mecanismo de clivagem do DNA pelas endonucleases homing da família HNH, por exemplo I-PpoI parece estar melhor estabelecido, porque a informação estrutural está disponível tanto para a enzima livre como para o substrato enzimático e complexos enzimático-produto, além de informação bioquímica detalhada para esta e enzimas relacionadas da superfamília ‘ββα-Me finger’. Estas enzimas requerem um ião Mg2+ como co-factor que está ligado a um Asn conservado. O íon hidroxil atacante é gerado por uma estabilização conservada do seu estado de transição envolve um Arg conservado e a protonação do grupo é proporcionada por uma molécula de água da esfera de hidratação do íon Mg2+.

Bactérias desenvolveram sistemas RM para combater bacteriófagos. Estes, por sua vez, desenvolveram vários meios de escapar da restrição por sistemas de RM bacteriófagos. D. Dryden (Edinburgh, UK) relatou os resultados de uma análise bioquímica do gene 0,3 da proteína do bacteriófago T7, que é um inibidor das enzimas de modificação de restrição do tipo I. Esta proteína liga-se estequiometricamente à enzima de restrição e, devido à sua forma alongada e carga superficial negativa, presumivelmente preenche completamente o local de ligação do DNA da enzima e, assim, impede a ligação do DNA.

RM sistemas consistem em endonucleases de restrição e metiltransferases de DNA (MTases) (revisto em Cheng, 1995; Robertson e Wolffe, 2000). Entretanto, como o padrão de metilação do DNA acrescenta informações ao DNA e, assim, amplia sua capacidade de codificação, as MTases não são apenas companheiras das enzimas de restrição nos sistemas de RM, mas têm muitas outras funções vitais. Em procariotas, elas desempenham papéis na reparação do DNA e na regulação da expressão e replicação do DNA. Na eucariotas, a metilação do DNA geralmente leva ao silenciamento transcripcional dos genes. Ela contribui para processos epigenéticos como a inativação do cromossomo X, impressão e regulação gênica. Com a descoberta de que várias MTases de DNA são essenciais para o desenvolvimento em ratos, a importância da metilação do DNA tornou-se amplamente aceita.

X. Cheng (Atlanta, GA) apresentou a estrutura da proteína Dnmt2, que poderia ser a primeira estrutura de uma MTase de ADN eucariótica. A proteína tem uma dobra MTase e possui todos os motivos catalíticos característicos, mas parece estar desprovida de qualquer atividade catalítica. Isto levanta questões tais como se é realmente uma enzima e qual é o seu substrato (ADN, RNA ou outra coisa qualquer). Outras discussões sobre enzimas eucarióticas por Cheng e A. Jeltsch (Giessen, Alemanha) trataram das enzimas Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b. Ambos os oradores relataram resultados obtidos com proteínas truncadas e domínios isolados destas enormes enzimas (compreendendo até 1700 resíduos de aminoácidos), bem como apresentaram resultados relativos à análise enzimática de enzimas purificadas. Como o domínio catalítico do Dnmt1 (∼500 resíduos de aminoácidos) não está ativo de forma isolada, ele deve estar sob rígido controle de outras partes da enzima. Esta interação pode ser necessária para garantir uma alta especificidade para o DNA hemimetílico. Apesar do progresso no campo, o processo de metilação do DNA em eucariotas, em particular os mecanismos que criam o padrão de metilação do DNA, ainda é pouco compreendido.

Somente se sabe mais sobre a metilação do DNA em procariotas. R. Gumport (Urbana, IL) apresentou a estrutura do M.RsrI MTase procariótico, confirmando a conjectura de que os domínios catalíticos de todos os MTases compartilham uma arquitetura comum. S. Klimasauskas (Vilnius, Lituânia), D.N. Rao (Bangalore, Índia), Gumport e Jeltsch discutiram a enzimologia molecular de quatro MTases procarióticas (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI e M.EcoRV). O ciclo catalítico destas enzimas envolve a ligação de DNA e cofactor, localização e reconhecimento do local alvo, e mudanças conformacionais do complexo, incluindo a inversão da base e transferência do grupo metilo (Figura 4).4). As diferenças em detalhes tornaram-se aparentes; por exemplo, a ordem de ligação do substrato e cofactor e a etapa de limitação da taxa difere em várias MTases. A 2-aminopurina provou ser uma boa ferramenta para analisar a cinética das alterações conformacionais que o DNA sofre em conjunto com as MTases, incluindo a mudança de base.

Fig. 4. Mecanismo de localização do local alvo por endonucleases de restrição e por metiltransferases de DNA. Primeiro o DNA é ligado de forma não específica, depois o local alvo é localizado por difusão facilitada (deslizamento e salto) no DNA. Os contactos com os locais alvo induzem alterações conformacionais da enzima e do ADN que, por sua vez, desencadeiam a catálise. Este mecanismo é comum entre a maioria das enzimas que interagem especificamente com o DNA.