Patogenie in vitro
Celele epiteliale columnare sunt celule moarte care experimentează două pH-uri extreme în același timp. În partea apicală, ele sunt scăldate în fluide intestinale foarte alcaline și în partea bazală sunt scăldate în hemolimfă ușor acidă. Aceste condiții sunt dificil de imitat în cultura celulară, fapt care poate explica lipsa de informații disponibile despre infecția primară.
Liniile celulare care suportă replicarea GV sunt rare și în prezent există doar pentru CpGV. În consecință, știm puțin mai multe despre mecanismele de infectare cu GV decât știm despre infectarea cu ODV. Chiar și așa, știm că, în timpul morfogenezei nucleocapsidelor GV, membrana nucleară a celulei gazdă se dezintegrează, un eveniment care nu întrerupe procesarea nucleocapsidelor. Dispariția membranei nucleare este distinctă și nu are loc în celulele gazdă infectate cu NPV.
Au fost create o serie de linii celulare de insecte care suportă infecții cu NPV. Majoritatea liniilor celulare sunt derivate din ovare sau embrioni de omidă. AcMNPV se poate replica în linii celulare derivate din mai multe specii de insecte, fapt care contribuie la faptul că acesta este cel mai bine studiat baculovirus. Într-o curbă de creștere standard cu un singur pas, AcMNPV BVs se produc de obicei 12-20 h după infecție (hpi), iar ocluziile, 20-48 hpi. Replicarea majorității celorlalți NPV în cultura celulară durează ore sau zile mai mult.
AcMNPV BV este de 1000 de ori mai infecțios decât ODV, în principal datorită prezenței proteinei sale de fuziune, GP64. BV intră în celulele lor țintă prin endocitoză mediată de clatrin. Nucleocapsidele BV pătrund adânc în citoplasma celulelor țintă prin eliberarea din endosomi. Folosind această strategie, nucleocapsidele ocolesc mediul posibil periculos care se află chiar sub membrana plasmatică și intră în celulă mai aproape de nucleu decât ar permite fuziunea la nivelul membranei plasmatice. Schimbările de conformație sensibile la pH pe care le experimentează proteinele de fuziune BV servesc la declanșarea unui eveniment de fuziune între învelișul viral și membrana endosomală.
Scăparea nucleocapsidei AcMNPV din endosom este urmată imediat de asocierea sa cu cablurile de F-actină. Formarea cablurilor este tranzitorie și are loc în timpul în care nucleocapsidele virale se deplasează spre nucleu și intră în acesta. În timpul tranzitului, nucleocapsidele virale se co-localizează cu un capăt al unui cablu de actină, posibil prin intermediul P78/83, o proteină de legare a F-actinei despre care se crede că este localizată la baza nucleocapsidelor. Asocierea nucleocapsidelor cu cablurile de F-actină și întârzierea expresiei genei reporter în prezența medicamentelor care perturbă funcția actină/miozină sugerează că cablurile pot facilita transportul nucleocapsidelor către nucleu sau pot media trecerea lor prin porii nucleari.
NPV și unele nucleocapside GV intră în nuclee prin porii nucleari. Unele GV se dezacoperă la porii nucleari, dar cea mai mare parte a dezacoperirii baculovirusurilor are loc în interiorul nucleului. Transcripția timpurie a genelor începe imediat, mediată de ARN polimeraza II (Pol II) a gazdei. Printre genele timpurii exprimate se numără un subset a cărui expresie duce la transportul eficient al G-actinei către nucleu și la acumularea în interiorul acestuia (figura 5). Această manipulare spectaculoasă a localizării actinei este esențială pentru producția de progenituri NPV și nu a fost descrisă pentru niciun alt agent patogen. Genele implicate în localizarea nucleară a actinei, identificate în experimentele de transfecție tranzitorie, includ ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 și Ac102. Două dintre gene, ie1 și Ac102, sunt conservate între toate NPV-urile și GV-urile lepidopterelor, iar ambele sunt esențiale.
Figura 5. G-actina nucleară în celulele infectate cu AcMNPV. (a) celule infectate colorate cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI); (b) celule infectate care exprimă proteina fluorescentă verde (GFP) transfectată cu actină. (c) Lipsa colorației cu rodamină-faloidină nucleară indică faptul că actina nucleară este monomerică.
Tranziția la stadiul tardiv al infecției reprezintă începutul perioadei de producere a progeniturilor BV; activitățile celulare sunt orientate spre sintetizarea componentelor virale la rate maxime, asamblarea acestora în produse nucleocapsidice și apoi exportarea lor. Sinteza macromoleculară a gazdei este oprită în această perioadă, dar structura cromatinei gazdei rămâne intactă până la moartea celulară. Genele virale târzii și foarte târzii sunt exprimate de o ARN-polimerază codificată de virus.
Microtubulele, reorganizate în timpul fazei timpurii a infecției, sunt depolimerizate de factorii produși în timpul fazei târzii, ceea ce duce la rotunjirea celulei (figura 6). În mod similar, G-actina, acumulată în nucleu în timpul fazei timpurii, se polimerizează în timpul fazei târzii, concomitent cu umflarea nucleului și dispariția structurilor nucleare vizibile ale gazdei (figura 7). Stroma virogenă, locul de sinteză a ADN-ului viral, se formează în centrul nucleului și este intercalată și înconjurată de o zonă electron-lucitoare numită „zona inelară”, un loc în care capsidele sunt asamblate și fixate în timpul încărcării genomului. F-actina nucleară se colocalizează împreună cu principala proteină de capsidă AcMNPV în zona inelară (figura 7).
Figura 6. Celule Sf21 infectate cu AcMNPV care prezintă diferite faze ale efectului citopatic (CPE). (a) Celule neinfectate. Se observă forma fusiformă și prezența structurilor de nucleocromatină. (b) Celule infectate cu AcMNPV care prezintă CPE timpuriu și târziu. Celulele sunt rotunjite din cauza depolimerizării microtubulilor, nucleii sunt mai mari și sunt curățați de structurile gazdei, iar stroma virogenă (vs) este înconjurată de zona inelară (rz). Stroma virogenă devine mai densă pe măsură ce avansează stadiul târziu al infecției. Poliedrele umplu nucleul în timpul stadiului foarte târziu al infecției (p).
Figura 7. F-actina nucleară în celula infectată cu AcMNPV în timpul expresiei genetice târzii. (a) Colorația DAPI indică localizarea nucleului. (b) Fluorescența verde indică faptul că proteina capsidă este localizată în principal în zona inelară a nucleului. (c) Colorația cu rodamină-falloidină arată că F-actina se colocalizează împreună cu capsida în zona inelară.
F-actina nucleară este necesară pentru producerea BV. În prezența medicamentelor care perturbă F-actina, capsidele virale sunt malformate și apar ca structuri tubulare lungi juxtapuse la membrana nucleară internă cu pete rare de material electronic dens. Plăcile de bază și structurile capsidelor prezente în mod normal nu sunt evidente și se produce un exces de profile membranoase. Sinteza ADN-ului viral are loc în ritm normal, dar genomurile nu sunt împachetate, iar stroma virogenă are un aspect „relaxat” în comparație cu stroma normală. În mod interesant, fenotipul pentru absența factorului foarte târziu AcMNPV-1 (VLF-1) este similar, sugerând că VLF-1 poate fi implicat în legarea capsidelor la stroma virogenă și că F-actina este o componentă a stromei de care capsidele sunt atașate, direct sau indirect.
P78/83, o proteină capsidă minoră exprimată târziu în timpul infecției, este esențială pentru viabilitatea AcMNPV. Această caracteristică a fost observată cu peste 30 de ani în urmă și a fost exploatată în primele kituri comerciale de exprimare a baculovirusurilor. Se consideră că P78/83 (78 kDa atunci când este nefosforilată și 83 kDa atunci când este fosforilată) face parte din plăcile de bază ale capsidelor BV și ODV. P78/83 este o proteină care se leagă de F-actina, iar această activitate poate contribui la legarea capsidelor de matricea nucleară în timpul asamblării. În mod interesant, P78/83 conține o altă activitate care explică de ce este esențială; aceasta promovează polimerizarea actinei în interiorul nucleului. P78/83 conține domenii conservate în membrii familiei de proteine din sindromul Wiskott-Aldrich (WASP), factori care promovează nuclearea filamentelor de actină. Membrii familiei WASP reglează pozitiv activitatea de nucleare a actinelor a complexului Actin Related Protein (Arp)-2/3. Complexul cu șapte subunități, conservat la toate eucariotele, este translocat în nucleu în celulele infectate cu AcMNPV și este activat de P78/83. Mutațiile în P78/83 care duc la scăderea capacității de promovare a nucleării actinei duc, în mod corespunzător, la scăderea capacității de producere a BV infecțioase.
Imediat după intrarea în nucleu, ADN-ul AcMNPV adoptă o structură de tip nucleosomal și utilizează nucleozomii și procesele legate de nucleozomi în replicarea genomului. Prin urmare, o componentă a strategiei de replicare virală pare a fi deturnarea unor componente, dacă nu chiar a întregii capacități de remodelare a cromatinei gazdei. Dovezile recente sugerează că familia de proteine BRO (baculovirus repeated orf) este probabil un participant la acest proces. Proteinele BRO sunt exprimate devreme în timpul infecției, se leagă de ADN monocatenar (ssDNA) și de histonele de bază și se separă de histone în experimentele de fracționare. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus și lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus au toate mai multe gene bro. AcMNPV poartă doar o singură genă bro, înrudită cu BmNPV bro-d, care este esențială.
P6.9 codificată de AcMNPV, proteina de împachetare a genomului extrem de bazică, începe să se acumuleze în timpul etapei târzii a infecției și apare o structură alternativă a cromatinei.
Interacțiunile P6.9-DNA sunt controlate de starea de fosforilare a P6.9. În timpul împachetării genomului, ADN-ul genomic din stroma virogenă se leagă cu P6.9 pe măsură ce P6.9 este defosforilat, condensându-se în învelișul preformat al capsidei printr-o deschidere într-o structură terminală conică. Structurile conice sunt situate proximal față de stroma virogenă, cu învelișurile capsidice acoperite de plăci de bază care se extind distal într-un spațiu mai puțin dens în electroni, zona inelară. F-actina și proteina capsidei se colocalizează în zona inelară, împreună cu P78/83 și complexul Arp2/3. Această etapă de replicare este cea care este afectată atât de medicamentele care perturbă F-actina, cât și de absența VLF-1.
Cu debutul fazei foarte târzii a infecției există o reducere a producției de BV și există un debut al producției de ODV. Nucleocapsidele nou asamblate rămân în nucleu, unde sunt învelite în plicuri despre care se crede că provin din membrana nucleară internă. Virionii înveliți, dar nu și nucleocapsidele nedezvoltate, sunt ocluși într-o matrice proteică pentru a forma capsule sau poliedre. Celulele se lizează în cele din urmă, eliberând ocluziile în mediu.
.