Diferențierea porcilor mistreți și a porcilor domestici în alimentație, prin selectarea a doi loci genetici prin PCR în timp real

Proiectarea primerilor și a sondelor

Pentru proiectarea primerilor și a sondelor, am selectat polimorfisme care au fost deja raportate pentru a permite discriminarea porcilor mistreți și a porcilor domestici. Am început cu SNP-ul g.299084751 C > T din gena NR6A1, care s-a dovedit a fi asociat cu numărul de vertebre toracice și lombare: mistreții, care sunt homozigoți pentru alela de tip sălbatic g.299084751 C, au 19 vertebre, în timp ce porcii domestici, care sunt homozigoți pentru g.299084751 T, au 21-23 de vertebre. În studiul lui Fontanesi et al., acest SNP a fost utilizat pentru a discrimina porcii mistreți și porcii domestici prin PCR-RFLP10. Ne-am propus să proiectăm o pereche de amorsă pentru amplificarea regiunii țintă atât la mistreț, cât și la porcul domestic, și două sonde TaqMan, specifice pentru alela mistrețului (g.299084751 C) și, respectiv, pentru alela porcului domestic (g.299084751 T). Testul duplex ar trebui să facă posibilă detectarea simultană a mistrețului și a porcului domestic într-un singur gode. În total, am proiectat patru amorse înainte, trei amorse inverse, patru sonde pentru mistreți și o sondă pentru porci domestici și le-am combinat pentru a obține 21 de sisteme de amorse/sonde (Chr1a – u, tabelul suplimentar 1). Sistemul de amorsă/sondă Chr1a a vizat catena superioară, iar sistemele de amorsă/sondă Chr1b-u catena inferioară a genei NR6A1. Într-o serie de experimente, am investigat dacă sistemele de amorsă/sondă erau specifice pentru mistreț sau dacă prezentau reactivitate încrucișată cu rasele de porci domestici/crucișători. Sistemul de primer/probe Chr1a a avut ca rezultat o valoare ΔCt ≥ 10,56 între porcul domestic și mistrețul sălbatic (tabelul suplimentar 2). Pentru sistemele primer/probe Chr1i – o, valorile ΔCt au variat între 8,65 și 11,19. Sistemele de amorsare/sondă Chr1b – h și Chr1p – t nu au determinat o creștere a semnalului de fluorescență pentru rasele/crucile de porci domestici. Deoarece sistemul amorsă/probă Chr1q a avut ca rezultat cea mai mică valoare Ct (24,77; n = 2) pentru mistreț, am testat aplicabilitatea acestuia în combinație cu o sondă TaqMan pentru porcul domestic în formatul de testare duplex (sistemul amorsă/probă Chr1u, tabelul suplimentar 1). Deoarece valorile Ct atât pentru mistreț (26,21; n = 2), cât și pentru porcul domestic (27,90; n = 2) au fost satisfăcătoare, toate experimentele PCR ulterioare care au vizat SNP g.299084751 C > T au fost efectuate cu sistemul primer/probe Chr1u. În cele ce urmează, testul PCR duplex în timp real se numește assayChr1, constând în testul pentru porcul domestic, assayChr1D, care implică primerul înainte Chr1f4, primerul invers Chr1r2 și sonda Chr1p1D, și testul pentru mistreț, assayChr1W, care implică primerul înainte Chr1f4, primerul invers Chr1r2 și sonda Chr1p4W (Fig. 1A).

Secvențe parțiale ale (A) genei NR6A1 de pe cromozomul 1 care poartă SNP g.299084751 C > T, vizat de testul duplex „assayChr1”, și (B) cromozomul 9 purtător al SNP g.118314929 A > G (rs81416363), vizat de cele două teste singleplex „assayChr9D” și „assayChr9W”. Săgețile indică pozițiile amorselor (gri închis) și ale sondelor (gri deschis). (A) Duplex assayChr1 a inclus primerul înainte Chr1f4, primerul invers Chr1r2, sonda Chr1p4W și sonda Chr1p1D. (B) Singleplex assayChr9D a inclus primerul înainte Chr9f8, primerul invers Chr9r17D și sonda Chr9p2; singleplex assayChr9W a inclus primerul înainte Chr9f8, primerul invers Chr9r12W și sonda Chr9p2. Bazele specifice subspeciilor sunt reprezentate cu bold (săgeți roșii verticale) și bazele nepotrivite cu albastru (săgeți albastre verticale).

Din moment ce am aflat din literatura de specialitate că puterea de discriminare vizând un singur polimorfism este, cel mai probabil, insuficientă, am căutat un alt locus genetic adecvat. Investigând 20 de SNP-uri în ceea ce privește aplicabilitatea lor pentru a diferenția porcul mistreț de porcul domestic, Beugin et al. au descoperit că SNP-urile rs80864596 (intergenic, cromozomul 5), rs80796712 (glicogen sintetază kinază 3-beta, cromozomul 13) și rs81416363 (intergenic, cromozomul 9) au prezentat cea mai mare putere de discriminare11. Prin urmare, am selectat aceste trei SNP-uri pentru proiectarea sistemelor de primer/probe. În comparație cu proiectarea primerului/probei pentru SNP g.299084751 C > T, am urmărit o strategie diferită. În loc să localizăm baza specifică subspeciei în sondă, am localizat-o în penultimul loc de la capătul 5′ al amorselor înainte sau înapoi. Pentru a spori specificitatea, am introdus deliberat nepotriviri de baze. Această așa-numită tehnică MAMA (mismatch amplification mutation assay)12,13 are avantajul de a fi destul de eficientă din punct de vedere al costurilor, deoarece una și aceeași sondă poate fi testată cu un număr de amorse care diferă în ceea ce privește poziția nepotrivirii. În prima serie de experimente, am introdus baza de nepotrivire fie în poziția a 3-a, fie în poziția a 6-a de la capătul 3′ al primerului care poartă baza specifică subspeciei. Atunci când am dezvoltat teste PCR în timp real pentru cerb roșu, cerb lopătar și, respectiv, cerb sika14,15,16, această strategie s-a dovedit a fi de succes. Cu toate acestea, în studiul de față, niciunul dintre sistemele de primer/probe (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, tabelul suplimentar 1) nu a permis diferențierea între porcul domestic și mistrețul sălbatic (tabelul suplimentar 3). Cele mai bune rezultate (valoarea ΔCt între rasele de porci domestici/încrucișate și mistreți ≥5,24) au fost obținute cu sistemul amorsă/probă Chr9j. În acest sistem amorsă/probă, care vizează SNP rs81416363 pe cromozomul 9, baza de nepotrivire a fost localizată în a treia poziție de la capătul 3′ al amorsă (TTCACG → TTCCCG). Pentru a crește specificitatea, am introdus un alt nepotrivire în a 4-a (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) sau a 5-a poziție (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) de la capătul 3′ al amorsă. Introducerea unor nepotriviri suplimentare s-a dovedit a fi un succes. Cu sistemul amorsă/probă Chr9r (tabelul suplimentar 1) am obținut atât cea mai mică valoare Ct pentru mistreț (22,09; n = 2), cât și cea mai mare valoare ΔCt (10,52) între rasele de porci domestici/încrucișate și mistreț (tabelul suplimentar 3). Acest test PCR în timp real pentru mistreț, vizând SNP rs81416363 localizat pe cromozomul 9, s-a bazat pe sistemul de primer/probe Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

În continuare, am aplicat strategia MAMA pentru a dezvolta testul PCR în timp real corespunzător, vizând SNP rs81416363 localizat pe cromozomul 9, pentru porcul domestic. Am localizat baza specifică porcilor domestici la penultima bază de la capătul 5′ al primerului și baza de nepotrivire la a 3-a poziție de la capătul 3′ (sisteme primer/probă Chr9v – x; tabelul suplimentar 1). Cu toate acestea, introducerea unei baze nepotrivite nu a fost suficientă pentru a permite diferențierea porcilor domestici și a mistreților. Introducerea bazelor nepotrivite la a 3-a și a 5-a poziție de la capătul 3′ al primerului (sisteme primer/probe Chr9y – ag) a condus la o valoare ΔCt ≥ 4,83. Atunci când nepotrivirile au fost în pozițiile 3 și 4 (sisteme primer/probe Chr9ah – aj), valoarea ΔCt a fost ≥5,85. Prin introducerea a trei baze nepotrivite consecutive lângă baza specifică subspeciei (sisteme de amorsă/probe Chr9ak – am), specificitatea a putut fi crescută. Sistemul amorsă/probă Chr9ak, în care nepotrivirile au fost în pozițiile 3, 4 și 5 (TTCATG → TGGTTG), a condus la cea mai mare valoare ΔCt de ≥9,97. Astfel, toate experimentele ulterioare au fost efectuate cu sistemul primer/probe Chr9ak. În cele ce urmează, cele două teste singleplex care vizează SNP rs81416363 pe cromozomul 9 sunt denumite assayChr9D, incluzând primerul înainte Chr9f8, primerul invers Chr9r17D și sonda Chr9p2, și assayChr9W, incluzând primerul înainte Chr9f8, primerul invers Chr9r12W și sonda Chr9p2 (Fig. 1B).

Optimizarea concentrației și a raportului amorsă/probă

Toate rezultatele prezentate mai sus au fost obținute cu concentrații de amorsă și sondă de 500 nM și 200 nM (sisteme amorsă/probă care vizează cromozomul 1) și, respectiv, 200 nM și 100 nM (sisteme amorsă/probă care vizează cromozomii 5, 9 și 13). În continuare, am investigat dacă specificitatea testelor PCR în timp real ar putea fi crescută prin optimizarea concentrației și a raportului amorsă/sondă. În cazul testuluiChr1, s-a constatat că concentrațiile optime de amorsă și sondă sunt de 1 000 nM și, respectiv, 200 nM (tabelul suplimentar 4). În cazul testuluiChr9W și al testuluiChr9D, un surplus de amorsă purtând atât baza specifică subspeciei, cât și bazele de nepotrivire a dus la valori ΔCt mai mari între subspecia cu reacție încrucișată și specia țintă. Cea mai mare selectivitate a assayChr9W și assayChr9D a fost obținută cu concentrații de amorsă directă/amorsă inversă/sondă de 12,5/200/50 nM și, respectiv, 62,5/800/50 nM.

Teste de reactivitate încrucișată

În continuare, am efectuat teste de reactivitate încrucișată cu izolate de ADN de la mistreți, de la diverse rase de porci domestici/crucișători și de la alte 22 de specii de animale enumerate în tabelul suplimentar 5. Figura 2A-D prezintă curbele de amplificare obținute cu testulChr9W, testulChr9D, testulChr1W și, respectiv, testulChr1D. TestulChr9W a prezentat o ușoară reactivitate încrucișată cu porcii domestici, cerbul sika, ibexul alpin, oaia, capra și șampania (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), iar testulChr9D cu mistreții, cerbul sika, elanul, calul și curcanul (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Spre deosebire de testele care vizează SNP rs81416363 de pe cromozomul 9, testulChr1 nu a prezentat nicio reactivitate încrucișată (cu excepția testuluiChr1W pentru căprior în doar una din patru replici). Am analizat, de asemenea, izolate de ADN din 50 de specii de plante utilizate în mod obișnuit ca ingrediente alimentare (tabelul suplimentar 6). Nu s-a constatat că niciunul dintre teste nu a prezentat reactivitate încrucișată cu niciuna dintre speciile de plante.

Rezultatele obținute prin efectuarea testelor de reactivitate încrucișată cu izolate de ADN (10 ng/µL) de la 22 de specii de animale și mistreț/porc domestic. (A) testChr9W, (B) testChr9D, (C) testChr1W și (D) testChr1D.

Screening de diferite amestecuri master comerciale pentru aplicabilitatea lor

Într-o serie următoare de experimente, am investigat dacă tipul de amestec master comercial a influențat selectivitatea testelor. Am analizat izolate de ADN de la 23 de specii de animale, inclusiv 3 indivizi de mistreț și 11 rase/ încrucișări de porci domestici, cu un total de cinci amestecuri magistrale de la diferiți furnizori. Amestecurile principale și programele de temperatură respective sunt prezentate în tabelul suplimentar 7. În general, tipul de master mix a influențat atât valorile Ct absolute, cât și valorile ΔCt între speciile țintă și (sub)speciile cu reacții încrucișate. Cu toate acestea, testele PCR în timp real au fost influențate într-o măsură diferită. În cazul testuluiChr9W, de exemplu, amestecurile 2 și 3 au avut ca rezultat valori Ct mai mari decât master mix 1 (master mix standard în prezentul studiu), 4 și 5 (Ct ± SD (n = 6): amestec 1: 25,03 ± 0,15; amestec 2: 31,17 ± 1,70; amestec 3: 28,43 ± 0,13; amestec 4: 26,64 ± 0,10; amestec 5: 26,64 ± 0,17). În cazul testuluiChr9D, tipul de amestec magistral a avut o influență asupra valorilor ΔCt și, prin urmare, asupra selectivității testului. Valorile ΔCt obținute cu amestec maestru 1, 2, 3 și 4 au fost ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 și, respectiv, ≥ 5,86, în timp ce cu amestecul maestru 5 nu s-a observat niciun fel de reactivitate încrucișată. În cazul testuluiChr1, s-au obținut valori Ct destul de similare cu master mix 1, 3 și 4. Cu toate acestea, master mix 2 și 5 nu au dus la formarea niciunui produs, cel mai probabil pentru că aceste amestecuri nu sunt adecvate pentru multiplexare. Pe baza acestor constatări, recomandăm cu căldură să se testeze aplicabilitatea în cazul în care se intenționează să se utilizeze un alt tip de master mix.

Robustețe

Robustețea testelor PCRs în timp real a fost investigată prin variația temperaturii de recoacere ±1 °C și a volumului amestecului de reacție pe puț cu ±5% și prin aplicarea a două ciclatoare PCR în timp real diferite. Experimentele au fost efectuate cu izolate de ADN de la mistreț, porc domestic și căprioară. Pentru testulChr9W și testulChr9D, valorile Ct au fost foarte asemănătoare cu cele obținute în condiții standard (valori ΔCt <1,00), cu excepția cazului în care temperatura de recoacere a fost mărită la 61 °C (valori ΔCt ≤2,16 și, respectiv, ≤1,57). Cu valori ΔCt ≤0,77, testulChr1 s-a dovedit a fi și mai robust. Nici reducerea volumului total de reacție, nici utilizarea unui alt ciclist PCR în timp real nu au influențat substanțial valorile Ct, demonstrând robustețea testelor PCR în timp real.

Intervalul de lucru, intervalul liniar și eficiența amplificării

Analizând un izolat de ADN de porc mistreț (211 µg/mL) și două izolate de ADN de porc domestic (158 µg/mL și 160 µg/mL) diluate în serie în apă (1:2-1:524,288), testulChr9W, testulChr9D, testulChr1W și testulChr1D au fost liniare între 211 µg/mL și 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL și 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL și 6 ng/mL (R2 = 0,9994) și, respectiv, 160 µg/mL și 10 ng/mL (R2 = 0,9988) (Fig. 3A). Eficiențele de amplificare calculate pe baza pantelor curbelor standard au fost de 83 %, 96 %, 93 % și, respectiv, 95 %. În plus, intervalul de liniaritate a fost evaluat prin analizarea izolatelor de ADN de mistreț și de porc domestic diluate în serie în ADN de spermă de hering. Pentru testulChr9W și testulChr9D, liniaritatea a variat de la 20 µg/mL la 20 ng/mL (R2 = 0,9988) și, respectiv, de la 20 µg/mL la 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (Fig. 3B). În cazul testuluiChr1W și al testuluiChr1D, liniaritatea a fost în intervalul de la 20 µg/mL la 5 ng/mL (R2 = 0,9978) și, respectiv, de la 20 µg/mL la 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectiv 20 µg/mL la 10 ng/mL (R2 = 0,9988). Eficiențele de amplificare calculate pe baza pantelor curbelor standard au fost de 76%, 90%, 97% și, respectiv, 101%.

Regimul de liniaritate al celor patru teste, (A) determinat în apă ca fond și (B) determinat în ADN de spermă de hering ca ADN de fond nețintă.

Aceste rezultate indică faptul că intervalul de lucru al testelor PCR în timp real este aproape identic, în timp ce intervalul de liniaritate este mai îngust pentru testele care vizează cromozomul 9 decât pentru cele care vizează cromozomul 1. Toate eficiențele de amplificare au fost cuprinse între 90 % și 110 %, așa cum se recomandă în orientările ENGL17 , cu excepția testuluiChr9W (83 % în apă, 76 % în ADN de spermă de hering). Eficiența de amplificare mai mică a testuluiChr9W este cauzată, cel mai probabil, de scăderea stabilității de legare a amorselor din cauza nepotrivirilor, introduse pentru a crește selectivitatea pentru specia animală țintă.

Limita de detecție (LOD) în ADN de spermă de hering și ADN de porc ca ADN de fond

Limita de detecție (LOD) a fost definită ca fiind cea mai mică concentrație de ADN care a dus la o creștere a semnalului de fluorescență în cel puțin 19 din 20 de replici. În plus, valoarea Ct ar trebui să fie sub valoarea Ct obținută pentru speciile care reacționează încrucișat.

În ADN de spermă de hering, LOD al testuluiChr9D (1,0%, w/w, Fig. 4A) a fost ușor mai mare decât LOD-ul celorlalte trei teste (0,2%, p/p, Fig. 4B-D). LOD-ul mai ridicat al testuluiChr9D este cauzat de reactivitatea încrucișată cu mistrețul (valoarea ΔCt între mistreț și porcul domestic doar ≥8,41).

Determinarea LOD prin analizarea unor diluții în serie de (A-D) amestecuri de ADN care conțin ADN de mistreț sau de porc domestic în ADN de spermă de hering și (E-H) un amestec de ADN care conține ADN de mistreț în ADN de porc domestic sau ADN de porc domestic în ADN de mistreț ca ADN de fond. (A,E) au fost obținute prin utilizarea testuluiChr9D, (B,F) prin utilizarea testuluiChr9W, (C,G) prin utilizarea testuluiChr1D și (D,H) prin utilizarea testuluiChr1W. Măsurătorile au fost efectuate în 20 de repetiții. Cercurile reprezintă valorile Ct individuale, iar liniile orizontale indică valorile medii.

În plus, am determinat LOD-ul testelor PCR în timp real pentru mistreț, assayChr1W și assayChr9W, în ADN de porc domestic ca fond, și cel al testelor pentru porc domestic, assayChr1D și assayChr9D, în ADN de mistreț ca fond. Cu 2%, 0,2%, 0,2%, 5% și 2% (g/g), LOD ale testuluiChr9D (Fig. 4E), testuluiChr9W (Fig. 4F), testuluiChr1D (Fig. 4G) și testuluiChr1W (Fig. 4H) au fost destul de diferite. LOD-ul mai ridicat al testuluiChr1D în prezența ADN de mistreț a fost cauzat de suprimarea semnalului, cel mai probabil din cauza concurenței dintre cele două sonde pentru secvența țintă în formatul de testare duplex. Pentru a investiga mai detaliat suprimarea semnalului, au fost analizate amestecuri de ADN care conțineau fie 25 % (p/p) ADN de mistreț în ADN de porc domestic, fie 25 % (p/p) ADN de porc domestic în ADN de mistreț, pe lângă controalele pozitive (ADN de mistreț și, respectiv, ADN de porc domestic).

Când am comparat martorii pozitivi cu standardele diluate la 1:4 care conțineau ADN nețintă, nu am constatat o diferență în curbele de amplificare (valorile ΔRn) pentru testulChr9W și testulChr9D (Fig. 5A,B). Cu toate acestea, în cazul assayChr1W și assayChr1D, semnalele de fluorescență (valorile ΔRn) obținute pentru controlul pozitiv au fost mai mari decât cele obținute pentru standardul diluat 1:4 la aceeași concentrație de ADN țintă (Fig. 5C,D).

Curbe de amplificare (în vedere semi-log) obținute pentru amestecuri de ADN (20 ng/µL) care conțin 25 % (p/p) din subspecia țintă (mistreț sau porc domestic) și 75 % (p/p) din subspecia nețintă (mistreț sau porc domestic) și diluții în serie ale acestora (1:4 până la 1:1,024). Izolatele de ADN (5 ng/µL) de la mistreț și, respectiv, de la porc domestic, au fost utilizate ca martori. TestulChr9W (A) și testulChr9D (B) prezintă reactivitate încrucișată cu subspecia nețintă. AssayChr1W (C) și assayChr1D (D) prezintă suprimarea semnalului în prezența subspeciilor nețintă.

Repetabilitate

Repetabilitatea testelor PCR în timp real a fost investigată prin analizarea amestecurilor de extract de carne care conțineau 30 % (g/g) ADN țintă și 70 % (g/g) ADN de subspecii nețintă, precum și diluții în serie ale acestora, în dublu exemplar de cinci ori în patru zile diferite. RSD a valorilor Ct a fost ≤1,0 % (testChr1W), ≤1,9 % (testChr9W), ≤2,3 % (testChr1D) și ≤3,5 % (testChr9D), demonstrând repetabilitatea ridicată a testelor.

Analiza probelor provenite de la indivizi mistreți și porci domestici

Aprobările PCR în timp real au fost aplicate la analiza probelor provenite de la 64 de indivizi porci domestici, inclusiv 14 rase și 6 rase încrucișate (Fig. 6A). În plus, am analizat un total de 30 de probe de porci mistreți din 5 țări diferite (Austria, Estonia, Germania, România și SUA, Fig. 6B). În cazul unui individ de mistreț din Europa, originea exactă a fost necunoscută. Fiecare eșantion a fost analizat în cel puțin patru repetiții. La fiecare placă PCR, s-a adăugat un control pozitiv (amestec de ADN, 10 ng/µL), care conținea subspecia țintă în aceeași concentrație ca și LOD, furnizând valoarea Ct limită.

Rezultatele obținute pentru (A) 64 de probe de porci domestici și (B) 30 de probe de mistreți. Măsurătorile au fost efectuate în cel puțin patru repetiții.

Când am analizat controalele pozitive în 14 repetiții, media ± SD a valorilor Ct a fost de 33,85 ± 0,93 (testChr9W), 35,19 ± 1,11 (testChr9D), 32,89 ± 0,28 (testChr1W) și 32,60 ± 0,47 (testChr1D). Cu excepția testuluiChr9D, toate probele care au avut ca rezultat valori Ct mai mari au fost considerate <LOD. În cazul testuluiChr9D, pentru mai multe probe de mistreț s-au obținut valori Ct ≥ 34,61. Pentru a reduce probabilitatea de rezultate fals pozitive, am stabilit valoarea Ct limită a testuluiChr9D la 34,00. Pentru aplicarea testuluiChr9W și a testuluiChr9D în analizele de rutină, recomandăm să se utilizeze un control pozitiv format din 2% (p/p) ADN de porc domestic, 0,2% (p/p) ADN de mistreț și 97,8% (p/p) ADN de spermă de hering.

Pentru analiza probelor de porc domestic cu testulChr9D, am obținut 63 de rezultate pozitive și un singur rezultat negativ (Mangalica 1) (Fig. 6). De la cei 12 indivizi din Cinta Senese, am analizat două părți diferite de carne, o probă de carne slabă (din longissimus dorsi) și o probă de grăsime subcutanată dorsală (din lomba) (datele nu sunt prezentate). Valorile Ct obținute pentru probele slabe (Ct mediu ± SD de 25,24 ± 0,44, n = 48) au fost foarte asemănătoare cu cele pentru probele de grăsime dorsală subcutanată (26,29 ± 0,35, n = 48). Când am analizat cele 30 de probe de mistreț cu testulChr9D, 21 nu au dus la o creștere a semnalului de fluorescență, dar nouă indivizi (unul din Austria, cinci din Germania și trei din SUA) au fost identificați ca fiind porci domestici.

Cu testulChr9W, majoritatea probelor de mistreț a fost atribuită corect, doar pentru trei probe (una din Germania și două din SUA) am obținut rezultate negative. Cu toate acestea, assayChr9W a condus, de asemenea, la rezultate pozitive pentru unii indivizi de porc domestic, inclusiv un porc Bentheim Black Pied, trei porci Krškopolje și trei porci Mangalica. În special, cei trei porci Mangalica din Austria au fost identificați ca fiind porci domestici, în timp ce cei trei indivizi din Germania au fost identificați ca porci mistreți. În cazul testuluiChr9, inclusiv al testuluiChr9W și al testuluiChr9D, 12 din cele 94 de probe de carne au condus la rezultate ambigue, deoarece s-a obținut o creștere a semnalului de fluorescență cu ambele teste PCR în timp real. Mai mult, un individ de porc Mangalica a fost identificat ca fiind mistreț și trei indivizi de mistreț ca fiind porci domestici.

În studiul lui Beugin et al.11, adecvarea SNP rs81416363 fusese testată pe porci mistreți „puri” vânat într-un parc natural din Vosges, în Franța, și pe un număr limitat de rase comerciale de porci (Landrace, Large White, Piétrain și Duroc). S-a constatat că mistreții sunt purtători ai alelei G (frecvență 100%, fără heterozigozitate), iar porcii domestici ai alelei A (frecvență 98%, heterozigozitate 5%).

Pentru a afla de ce testulChr9W și testulChr9D au condus la mai multe clasificări greșite și la unele rezultate ambigue, am genotipat probele respective de mistreți și porci domestici prin analiză de topire de înaltă rezoluție (HRM). Am aplicat analiza HRM deoarece este o tehnică puternică, eficientă din punct de vedere al timpului și al costurilor pentru genotiparea SNP18. Curbele de topire normalizate (Fig. 7A) indică faptul că genotipul homozigot G a fost găsit nu numai pentru probele de mistreț, ci și pentru proba Mangalica (proba 1) pentru care s-a obținut o creștere a semnalului de fluorescență cu testulChr9W, dar nu și cu testulChr9D. S-a constatat că probele de mistreț care au dus la o creștere a semnalului de fluorescență cu testulChr9D erau purtătoare de cel puțin o copie a alelei A. Patru indivizi mistreți au prezentat genotipul heterozigot, iar cinci au fost homozigoți pentru alela A. În plus, s-a constatat că cinci indivizi porci domestici, inclusiv trei indivizi Krškopolje din Slovenia, erau purtători atât de alela A, cât și de alela G. Astfel, prin genotiparea HRM am putut verifica dacă rezultatele obținute cu testulChr9W și testulChr9D sunt în concordanță cu genotipurile respective ale indivizilor. Cu toate acestea, rezultatele noastre indică faptul că cele două teste singleplex care vizează SNP rs81416363, assayChr9W și assayChr9D, nu permit discriminarea neechivocă a mistrețului și a porcului domestic.

Curbe HRM normalizate pentru (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) pe cromozomul 9 pentru homozigotul G (mistreț), homozigotul A (porc domestic) și heterozigotul A + G și (B) SNP g.299084751 C > T pe cromozomul 1 pentru homozigotul C (mistreț, homozigotul T (porc domestic) și heterozigotul C + T.

Cu ajutorul testuluiChr1D, toate probele de porci domestici, cu excepția a trei, au fost clasificate ca fiind porci domestici (Fig. 6). În conformitate cu testulChr9D, valorile Ct obținute pentru probele de grăsime slabă și subcutanată dorsală de la cei 12 indivizi din Cinta Senese au fost foarte asemănătoare [Ct mediu ± SD de 25,99 ± 0,25 (n = 48) și, respectiv, 26,36 ± 0,25 (n = 48)]. Cu toate acestea, cu testulChr1D, de asemenea, cinci din cele 30 de probe de mistreț au fost identificate ca fiind porci domestici. Analiza probelor de mistreț cu testulChr1W a condus la un singur rezultat negativ. Cu toate acestea, și o probă din Mangalica și șase indivizi din Turopolje au condus la o creștere a semnalului de fluorescență cu assayChr1W.

În studiul lui Fontanesi et al.10, SNP-ul g.299084751 C > T a fost genotipată prin analizarea probelor de la 293 de porci domestici din cinci rase comerciale (Large White italian, Landrace italian, Duroc italian, Landrace belgian și Piétrain) și 201 mistreți din sudul Europei Centrale (nordul Italiei) și sud-estul Europei (Slovenia și regiunile Balcanilor de Vest). Fontanesi et al. au constatat că toți indivizii de porci domestici sunt homozigoți pentru alela T. 7,5 % dintre indivizii mistreți erau purtători a cel puțin o copie a alelei T, indivizii din Europa de Sud-Est fiind mai frecvent (12,2 %) decât cei din Europa Centrală și de Sud (3,6 %). 11,1% dintre mistreții din Europa de Sud-Est aveau genotipul heterozigot C/T.

Când am genotipat indivizii mistreți și porci domestici pentru SNP g.299084751 C > T prin analiza HRM, am detectat, de asemenea, alela T nu numai la porcii domestici, ci și la unii mistreți (Fig. 7B). Individul mistreț din SUA a prezentat genotipul homozigot T, în timp ce individul mistreț din Austria Inferioară a purtat atât alela C, cât și pe cea T. Cu toate acestea, majoritatea indivizilor de mistreți a fost homozigotă pentru alela C. Acest rezultat indică faptul că creșterea semnalului de fluorescență pentru trei eșantioane de mistreți (Germania Bad Kissingen și Perleberg, precum și Europa) obținută cu testulChr1D nu a fost în concordanță cu genotipul acestora și, prin urmare, a fost cauzată de reactivitatea încrucișată. S-a constatat că majoritatea indivizilor de porci domestici sunt homozigoți pentru alela T. Cu toate acestea, s-a constatat că șase din opt indivizi din Turopolje prezentau genotipul heterozigot C/T, ceea ce explică de ce s-a obținut o creștere a semnalului de fluorescență atât cu assayChr1D, cât și cu assayChr1W. Frecvența ridicată a genotipului heterozigot C/T la Turopolje, o rasă de porci domestici din Croația, este în concordanță cu o lucrare foarte recentă a grupului de cercetare al lui Fontanesi. Prin genotiparea a 47 de indivizi din Turopolje, frecvența alelei T și a alelei C a fost raportată la 0,57 și, respectiv, 0,4319.

Rezultatele noastre demonstrează că nici cele două teste singleplex care vizează SNP rs81416363, nici testul duplex care vizează SNP g.299084751 C > T nu permit singure discriminarea neechivocă a porcilor mistreți și a porcilor domestici. Cu toate acestea, prin luarea în considerare a rezultatelor celor două teste singleplex și a testului duplex, puterea de discriminare poate fi crescută drastic. Rezultatele noastre demonstrează că, în cazul în care cele două teste pentru aceeași subspecie (de exemplu, assayChr9D și assayChr1D) conduc la o clasificare identică (în exemplul dat, porcul domestic), iar rezultatele obținute cu cele două teste pentru celelalte subspecii (în exemplul dat, assayChr9W și assayChr1W) sunt ambigue, probabilitatea de clasificare eronată este scăzută dacă ne bazăm pe rezultatele care sunt identice. Urmând această strategie, 86 (91,5%) din 94 de indivizi au putut fi atribuiți corect.

.