Modificare de restricție
Sistemele de modificare de restricție (RM) sunt omniprezente în regnul procariotic, unde servesc ca sisteme de apărare împotriva ADN-ului străin. În prezent, sunt cunoscute 47 de sisteme de tip I, 3320 de tip II și opt de tip III. R. Roberts (Beverly, MA) a subliniat faptul că, până de curând, enzimele de restricție au fost identificate prin obținerea de bacterii din colecții de culturi și mostre de mediu și prin analizarea acestora pentru activitatea de restricție. În prezent, este posibil să se analizeze noi secvențe de ADN pentru genele de ADN metiltransferază (MTase), care pot fi identificate după motivele lor conservate, și apoi să se caute genele asociate. Acestea sunt candidați buni pentru genele endonucleazelor de restricție, deoarece genele ADN-metiltransferazelor și ale endonucleazelor de restricție sunt adesea legate. Proiectele genomice recente au identificat un număr neașteptat de mare de sisteme RM putative în acest mod. De exemplu, în genomul Helicobacter pylori au fost identificate 25 de gene MTase diferite, iar unele dintre acestea au fost asociate cu genele enzimelor de restricție. Prin urmare, analizarea bazelor de date poate deveni o metodă foarte productivă de a găsi enzime de restricție cu noi specificități. A. Piekarowicz (Varșovia, Polonia) a raportat un exemplu de astfel de abordare care a dus la identificarea unei noi enzime de restricție de tip IC, NgoAXVI.
Enzimele de restricție de tip I și de tip III, precum și enzima McrBC dependentă de metil, necesită două situsuri de recunoaștere și depind de hidroliza ATP (McrBC: GTP) pentru scindarea ADN-ului (revizuit în Rao et al., 2000). Clivarea are loc atunci când două astfel de enzime se ciocnesc în timp ce translochează ADN-ul, ceea ce explică cerința a două situsuri (Figura (Figura2).2). T. Bickle (Basel, Elveția) a demonstrat că enzimele de tip I și McrBC pot fi, de asemenea, stimulate să cliveze ADN atunci când se lovesc de un blocaj nespecific. Enzimele de tip III, în schimb, sunt inhibate de astfel de blocaje, deoarece fiecare enzimă de translocare taie doar o singură catenă și are nevoie de cooperarea unei alte enzime pentru scindarea ambelor catene de ADN.
Figura 2. Model de activare a enzimelor de restricție care necesită ATP (sau GTP) pentru scindarea ADN-ului. După legarea a două molecule de enzime (sau complexe) la două situsuri de recunoaștere pe o moleculă de ADN liniară, ADN-ul este translocat într-un proces activ, dependent de energie, care necesită ATP sau GTP, în funcție de sistem. În acest fel, ADN-ul este pus în buclă. Clivarea are loc după ciocnirea a doi complecși de translocare, în locuri aleatorii din vecinătatea situsurilor de recunoaștere (enzimele de tip III și McrBC) sau mai departe de acestea (enzimele de tip I).
Deși majoritatea enzimelor de restricție de tip II sunt homodimeri care interacționează cu o singură copie a situsului lor palindromic de recunoaștere, există subtipuri care necesită cooperarea a două situsuri (revizuit în Pingoud și Jeltsch, 1997). După cum a subliniat S. Halford (Bristol, Regatul Unit), acesta este cazul nu numai pentru enzimele de tip IIe, cum ar fi NaeI, ci și pentru enzimele de tip IIf, cum ar fi SfiI, și pentru enzimele de tip IIS, cum ar fi FokI. Enzimele de tip IIf sunt homotetramere cu două situsuri de legare la ADN separate, fiecare fiind format din două subunități. SfiI este activă numai atunci când ambele situsuri de legare la ADN sunt ocupate, ceea ce duce la o clivare simultană a ambelor situsuri. În cazul FokI, care constă dintr-un domeniu de clivaj și un domeniu de recunoaștere, s-a demonstrat anterior că este necesară dimerizarea enzimei pe ADN pentru a avea loc clivajul. Halford a demonstrat acum că sunt necesare două situsuri de recunoaștere pentru o clivare eficientă, deoarece fiecare dintre domeniile de recunoaștere trebuie să interacționeze cu o secvență de recunoaștere. Toate cele trei tipuri de enzime acționează în mod optim cu două situsuri pe același ADN, unde prind ADN-ul între situsuri într-o buclă.
Continuă să fie descoperite enzime de restricție atipice de tip II. BbvCI este o enzimă de restricție heterodimeră care recunoaște o secvență asimetrică. Subunitățile sunt inactive individual, dar active împreună. Acest lucru face posibilă crearea unor enzime de nicking specifice prin inactivarea unei subunități folosind mutageneza dirijată, așa cum a fost raportat de G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Lituania) a obținut un rezultat similar pentru enzima de restricție heterodimeră Bpu10I. El a reușit, de asemenea, să relaxeze specificitatea de substrat a Eco57I, o enzimă monomerică de restricție și modificare, care are un singur domeniu de recunoaștere a țintei. În acest studiu, mutageneza aleatorie a fost utilizată pentru a genera o variantă care interacționează nu numai cu situl canonic CTGAAG, ci și cu siturile CTGGAG. Baza moleculară a acestei specificități relaxate nu a fost încă determinată. V. Siksnys (Vilnius, Lituania) a raportat descoperirea unei noi enzime de restricție de tip IIs, BfiI, care nu este dependentă de ioni metalici divalenți pentru scindare. Această enzimă prezintă o similitudine de secvență cu o nuclează nespecifică din Salmonella typhimurium și se presupune că utilizează un mecanism catalitic similar.
A. Pingoud (Giessen, Germania) a discutat mecanismul de scindare a ADN-ului de către enzimele de restricție de tip II și endonucleazele homing, care au o funcție comună, dar în general au structuri diferite și probabil urmează mecanisme diferite de scindare. În ciuda faptului că sunt disponibile informații detaliate privind structura pentru multe enzime de restricție care au un motiv catalitic comun, nu există un consens în ceea ce privește mecanismul catalitic sau numărul de ioni Mg2+ care sunt implicați în cataliză. În principiu, același lucru este valabil și pentru alte fosforil-transferaze cu un centru catalitic asemănător enzimelor de restricție. Exemple de astfel de proteine sunt enzima de reparare Vsr (E. coli) și Hjc resolvase (Pyrococcus furiosus). Structura cristalină a celei din urmă a fost prezentată de K. Morikawa (Osaka, Japonia) (Figura (Figura3).3). În schimb, mecanismul de scindare a ADN-ului de către endonucleazele homing din familia HNH, de exemplu I-PpoI, pare să fie mai bine stabilit, deoarece sunt disponibile informații structurale pentru enzima liberă, precum și pentru complexele enzimă-substrat și enzimă-produs, pe lângă informațiile biochimice detaliate pentru aceasta și pentru enzimele înrudite din superfamilia „ββα-Me finger”. Aceste enzime au nevoie de un ion Mg2+ ca și cofactor care este legat de un Asn conservat. Ionul hidroxil atacant este generat de un His conservat, stabilizarea stării de tranziție implică un Arg conservat, iar protonarea grupului de plecare este asigurată de o moleculă de apă din sfera de hidratare a ionului Mg2+.
Fig. 3. Comparația pliurilor endonucleazei de restricție a Hjc și Vsr ca exemplu de conservare a structurilor pentru enzime cu funcții înrudite. Diagramele de panglică ale Hjc și Vsr sunt prezentate în aceeași orientare după suprapunerea celor două structuri. Lanțurile laterale ale reziduurilor din situsul activ sunt evidențiate, iar cele două reziduuri Asp conservate sunt etichetate. Această figură a fost oferită cu amabilitate de T. Nishino și K. Morikawa.
Bacteriile au dezvoltat sisteme RM pentru a lupta împotriva bacteriofagilor. Aceștia, la rândul lor, au dezvoltat diverse mijloace de a scăpa de restricția sistemelor RM bacteriene. D. Dryden (Edinburgh, Marea Britanie) a raportat rezultatele unei analize biochimice a proteinei genei 0.3 de la bacteriofagul T7, care este un inhibitor al enzimelor de modificare a restricției de tip I. Această proteină se leagă stoichiometric de enzima de restricție și, datorită formei sale alungite și a încărcăturii de suprafață negative, se presupune că umple complet situsul de legare la ADN al enzimei și, astfel, împiedică legarea ADN-ului.
Sistemele RM constau din endonucleaze de restricție și ADN metiltransferaze (MTase) (analizate în Cheng, 1995; Robertson și Wolffe, 2000). Cu toate acestea, deoarece tiparul de metilare a ADN-ului adaugă informații ADN-ului și, astfel, extinde capacitatea de codificare a acestuia, MTazele nu sunt doar tovarășii enzimelor de restricție în sistemele RM, ci au multe alte funcții vitale. La procariote, acestea joacă roluri în repararea ADN-ului și în reglarea expresiei genice și a replicării ADN-ului. La eucariote, metilarea ADN-ului duce, în general, la reducerea la tăcere transcripțională a genelor. Ea contribuie la procesele epigenetice, cum ar fi inactivarea cromozomului X, imprimarea și reglarea genelor. Odată cu descoperirea faptului că mai multe ADN MTaze sunt esențiale pentru dezvoltarea la șoareci, importanța metilației ADN a devenit larg acceptată.
X. Cheng (Atlanta, GA) a prezentat structura proteinei Dnmt2, care ar putea fi prima structură a unei ADN MTaze eucariote. Proteina are un pliu de MTază și posedă toate motivele catalitice caracteristice, dar pare să fie lipsită de orice activitate catalitică. Acest lucru ridică întrebări, cum ar fi dacă este într-adevăr o enzimă și care este de fapt substratul său (ADN, ARN sau altceva). Alte discuții privind enzimele eucariote purtate de Cheng și A. Jeltsch (Giessen, Germania) au abordat enzimele Dnmt1, Dnmt3a și Dnmt3b. Ambii vorbitori au raportat rezultatele obținute cu proteine trunchiate și domenii izolate ale acestor enzime uriașe (care cuprind până la 1700 de reziduuri de aminoacizi), precum și prezentarea rezultatelor privind analiza enzimatică a enzimelor purificate. Deoarece domeniul catalitic al Dnmt1 (∼500 de reziduuri de aminoacizi) nu este activ în formă izolată, acesta trebuie să se afle sub controlul strâns al altor părți ale enzimei. Această interacțiune ar putea fi necesară pentru a asigura o specificitate ridicată pentru ADN-ul hemimetizat. În ciuda progreselor înregistrate în acest domeniu, procesul de metilare a ADN-ului la eucariote, în special mecanismele care creează modelul de metilare a ADN-ului, este încă slab înțeles.
Se cunosc ceva mai multe despre metilarea ADN-ului la procariote. R. Gumport (Urbana, IL) a prezentat structura MTazei M.RsrI procariote, confirmând conjectura că domeniile catalitice ale tuturor MTazelor au o arhitectură comună. S. Klimasauskas (Vilnius, Lituania), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport și Jeltsch au discutat despre enzimologia moleculară a patru MTaze procariote (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI și M.EcoRV). Ciclul catalitic al acestor enzime implică legarea ADN-ului și a cofactorilor, localizarea și recunoașterea situsului țintă și modificări conformaționale ale complexului, inclusiv răsturnarea bazei și transferul grupării metil (Figura (Figura4).4). Diferențele de detaliu au devenit evidente; de exemplu, ordinea de legare a substratului și cofactorului și etapa de limitare a vitezei diferă în diverse MTaze. 2-aminopurina s-a dovedit a fi un bun instrument pentru analiza cineticii modificărilor conformaționale pe care le suferă ADN-ul în complex cu MTazele, inclusiv răsturnarea bazei.
Fig. 4. Mecanismul de localizare a situsului țintă de către endonucleazele de restricție și ADN-metiltransferazele. Mai întâi ADN-ul este legat în mod nespecific, apoi situsul țintă este localizat prin difuzie facilitată (alunecare și salt) pe ADN. Contactele cu situsurile țintă induc modificări conformaționale ale enzimei și ale ADN-ului care, la rândul lor, declanșează cataliza. Acest mecanism este comun în cazul majorității enzimelor care interacționează în mod specific cu ADN.
.