Testul imunoenzimatic (ELISA) este un test imunologic utilizat în mod obișnuit pentru măsurarea anticorpilor, antigenelor, proteinelor și glicoproteinelor din probele biologice. Câteva exemple includ: diagnosticarea infecției cu HIV, teste de sarcină și măsurarea citokinelor sau a receptorilor solubili în supranaturalul celular sau în ser. Testele ELISA se efectuează, în general, în plăci cu 96 de godeuri, ceea ce permite măsurarea mai multor probe într-un singur experiment. Aceste plăci trebuie să fie plăci absorbante speciale (de exemplu, plăci NUNC Immuno) pentru a se asigura că anticorpul sau antigenul aderă la suprafață. Fiecare ELISA măsoară un antigen specific, iar kiturile pentru o varietate de antigeni sunt disponibile pe scară largă.
ElISA ilustrat în figura 1 este ceea ce se numește ELISA sandwich, aici se folosesc două seturi de anticorpi pentru a detecta produsele secretate, de exemplu citokine. Metoda se desfășoară etapizat, în ordinea prezentată. Prima etapă constă în acoperirea plăcii ELISA cu anticorpul de captare; orice exces de anticorp nelegat se spală apoi de pe placă. Anticorpul de captură este un anticorp crescut împotriva antigenului de interes.
Figura 1. Metoda ELISA. Se descrie mai sus un test ELISA tip sandwich, arătând etapele testului, numerotate în ordinea 1-4.
În continuare se adaugă proba (de exemplu, urină, ser sau supranatant celular). Orice antigen găsit în probă se va lega de anticorpul de captare care acoperă deja placa. Probele se adaugă de obicei în duplicat sau triplicat (pentru a permite analiza statistică) și în concentrații diferite pentru a garanta că se încadrează în nivelurile de detecție ale testului. Din nou, orice eșantion în exces se spală de pe placă.
În etapa 3, se adaugă anticorpul de detecție. Acest anticorp este marcat cu o enzimă, de obicei peroxidază de hrean sau fosfatază alcalină. Anticorpul de detecție se leagă de orice antigen țintă deja legat pe placă. În cele din urmă, se adaugă un substrat pe placă. Testele ELISA sunt de obicei cromogene, folosind o reacție care transformă substratul (de exemplu, TMB sau ABTS) într-un produs colorat care poate fi măsurat cu ajutorul unui cititor de plăci.
Determinarea concentrației de antigen într-o probă necesită producerea unei curbe standard folosind antigene cu o concentrație cunoscută (prezentată în figura 2). Concentrația de antigen într-o probă poate fi apoi calculată cu ajutorul densității optice (OD).
Figura 2. O curbă standard tipică. Este prezentată o curbă standard pentru un ELISA IFN-γ. Pentru a calcula concentrația antigenului într-o probă, trebuie să se pregătească o curbă standard folosind o soluție cu concentrație cunoscută.
.