DNA-syntesens mekanism

av Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Recenserad av Hannah Simmons, M.Sc.

Kopiering av livets recept

DNA, eller desoxiribonukleinsyra, är den biologiska molekyl som innehåller den information som behövs för att skapa en levande organism. När cellen delar sig för att bli två måste DNA kopieras så att båda cellerna innehåller den nödvändiga genetiska informationen. Syntesen eller tillverkningen av nya DNA-strängar i levande celler kallas ”DNA-replikation”.

DNA-replikation. Image Credit: Designua /

Herställning av en ny DNA-sträng

DNA finns som en dubbelspiral, där två DNA-strängar är bundna till två spiraler. Processen för DNA-replikation börjar när de två DNA-strängarna separeras. Ett enzym som kallas helicas avvecklar och separerar bindningarna mellan de två DNA-strängarna, och båda dessa separerade strängar fungerar som mallar från vilka nytt DNA tillverkas.

DNA-polymeraser är en grupp enzymer som tillverkar nytt DNA. Men för att enzymet ska fungera behöver det en primer – en kort nukleotidsekvens som är knuten till en av de enskilda DNA-strängarna. Under DNA-replikationen är primern vanligtvis en kort sekvens av ribonukleinsyra (RNA), som senare bryts ned och ersätts av DNA.

Primern ger en 3′-hydroxylgrupp på vilken DNA-polymeraset lägger till DNA:s prekursorer, nukleotiderna. När nukleotider läggs till i 3′-änden av primern eller den nya DNA-strängen bildas en bindning mellan 3′-hydroxylgruppen i primern/det nya DNA:t och nukleotikens 5′-fosfatgrupp.

Det finns fyra typer av DNA-nukleotider, som var och en har olika kvävebaser; adenin (A), cytosin (C), guanin (G) och tymin (T). Dessa finns alltid i par, A-T och C-G. Detta kallas ”Watson-Crick-basparning”, och om mallen har en A-nukleotid kommer alltså en T-nukleotid att läggas till den växande DNA-strängen. Om det är en G-nukleotid kommer en C-nukleotid att läggas till den växande strängen.

DNA:s riktning och hur den påverkar DNA-syntesen

DNA har en riktning, där den ena strängen går från 5′ till 3′ och den andra går från 3′ till 5′. I 5′-3′-strängen exponeras 3′-änden under syntesen av nytt DNA. Detta innebär att DNA-polymeras kan göra nytt DNA i mallen-DNA:s riktning.

Men när det gäller 3′-5′ ståndet skulle detta lämna 5′-ändan exponerad; hur hanterar DNA-polymeraset detta? I 3′-5′-strängen skapas nytt DNA genom att DNA-polymeraset gör korta 5′-3′-fragment, så kallade Okazaki-fragment. Sedan kopplar ett annat enzym, DNA-ligas, ihop Okazaki-fragmenten för att bilda den nya 3′-5′-DNA-strängen.

Proof-Reading

Ibland görs fel när man lägger till nukleotider på mall-DNA-strängen. Vissa DNA-polymeraser har vad som kallas ”3′-5′-exonukleasaktivitet”. 3′-5′-exonukleasaktiviteten, som arbetar mot polymeras- eller syntesaktiviteten, skär bort nukleotider som inte matchar mallen. Detta ger en korrekturläsning så att den nya DNA-strängen blir så korrekt som möjligt.

Hur utnyttjas detta inom molekylärbiologin?

DNA-syntesens egenskaper har använts i olika molekylärbiologiska tekniker; polymerasekedjereaktion (PCR) och DNA-sekvensering.

Polymerasekedjereaktion

PCR är en teknik som utvecklades på 1980-talet för att amplifiera en specifik del av DNA. DNA-primers utformas så att de täcker den intressanta regionen. Värme används för att separera de två DNA-strängarna, och temperaturen sänks sedan för att låta primrarna fästa vid DNA. Ett värmestabilt DNA-polymeras tillverkar sedan nya DNA-strängar som matchar den aktuella regionen genom att lägga till nukleotider i 3′-ändan av primrarna.

DNA-sekvensering

DNA-sekvensering innebär att man räknar ut ordningen på de baser (A, C, G, T) som finns i DNA. Sangersekvensering är en av de tidiga DNA-sekvenseringsteknikerna, där DNA-syntesen stoppas. Detta görs möjligt genom att ta bort hydroxylgruppen från nukleotidernas 3′-ändar. När dessa ”dideoxinukleotider” införlivas i DNA-strängen kan DNA-polymeraset därför inte lägga till nästa nukleotid. Dessa dideoxinukleotider blandas med nukleotider och därför skapas fragment av olika längd. Genom att ha dideoxy-A, dideoxy-C, dideoxy-G och dideoxy-T i separata reaktioner kan den sista nukleotiden i fragmentet bestämmas. När de har separerats efter storlek kan DNA-sekvensen sedan bestämmas genom att titta på vad den sista nukleotiden i fragmenten är enligt storlek.

Och även om moderna DNA-sekvenseringsmetoder är automatiserade och mindre arbetskrävande än Sanger-sekvensering finns det några som bygger på Sanger-sekvensering; till exempel kan olika fluorescerande färgämnen tillsättas till varje dideoxy-nukleotid och skillnaderna detekteras genom olika fluorescensfärger.

Fördjupad läsning

• Allt DNA-innehåll
• Vad är DNA?
• DNA:s egenskaper
• DNA:s kemiska modifieringar
• DNA:s biologiska funktioner

Skrivet av

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama är forskare och vetenskaplig författare. Hon fick sin doktorsexamen från University of Bath, Storbritannien, efter en avhandling inom mikrobiologi, där hon tillämpade funktionell genomik på Staphylococcus aureus . Under sina doktorandstudier samarbetade Maho med andra akademiker om flera artiklar och publicerade även en del av sitt eget arbete i vetenskapliga tidskrifter med expertgranskning. Hon presenterade också sitt arbete vid akademiska konferenser runt om i världen.

Citat

.