Högupplöst kolokalisering av Cy3 och Cy5 på makromolekyler i en enda molekyl mäter intramolekylära avstånd genom tiden

Material och metoder

Förberedelse av duplex-DNA. För att framställa duplex-DNA-molekylerna med 30 bp hybridiserades två oligonukleotider med följande sekvens och modifieringar (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotiden 5′-GGGTATATGGAGAGATTTTTAGCGGAGAGTGACAGC-3′ märktes med Cy5 i 5′-änden och med Cy3 i 3′-änden. Den komplementära oligonukleotiden märktes med biotin i båda ändarna.

Proteinexpression och rening. YFP-genen (Yellow fluorescent protein) i p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM-plasmidet (en gåva från H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Philadelphia) raderades genom PCR. Den resulterande p2Bac/pFastBac-M5-CaM-plasmiden kodar för kycklingmyosin V som är trunkerat vid Glu-1099. En leucinblixtlås följde den naturliga spiralen för att säkerställa dimerisering. För att underlätta rening var myosin V-proteinet N-terminalt märkt med en FLAG-tagg (DYKDDDDDDK). Två rekombinanta baculovirus genererades för proteinuttryck i Sf9-celler. Den ena kodade för det trunkerade myosin V och Drosophila melanogaster calmodulin som härstammar från p2Bac/pFastBac-M5-CaM-plasmidet. Det andra viruset kodade för den humana essentiella lätta kedjan från plasmidet p2Bac/pFastBac-ELC. Båda virusen användes för saminfektion av Sf9-celler. Proteinet uttrycktes och renades enligt beskrivning av Sweeney et al. (20).

Kalmodulinmärkning och utbyte. Calmodulin uttrycktes och märktes med Cy3 eller Cy5 enligt följande: En enda cystein infördes i calmodulin från sjöborre med hjälp av mutationen Q143C. Detta calmodulin uttrycktes i Escherichia coli och renades enligt beskrivningen i ref. 21. Kalmodulinet märktes med antingen Cy3-maleimid eller Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) i en 1,4-faldig molär relation (i DMSO) i 20 minuter. Överflödigt färgämne avlägsnades genom gelfiltrering i utbytesbuffert (nedan), följt av hydrofob absorption över natten på BioBeads (Bio-Rad). Inkorporeringen av märket var 102 % för Cy3-calmodulin och 75 % för Cy5-calmodulin. Alikvots förvarades vid -80°C.

Utbytet av märkt calmodulin på myosin V utfördes enligt beskrivningen men med vissa modifieringar (22). Myosin V (150 nM) inkuberades med 0,7 nM Cy3-märkt calmodulin och 0,8 nM Cy5-märkt calmodulin i utbytesbuffert (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) vid 22 °C i 2 minuter. För att byta ut calmoduliner tillsattes 0,9 mM CaCl2 och blandningen inkuberades vid 22 °C i 5 minuter. Reaktionen släcktes med 7 mM EGTA. Reaktionsblandningen applicerades på en 100K MWCO Nanocep ultrafiltreringsanordning (Pall) och tvättades tre gånger med lika stora volymer AB (nedan) för att rena myosin V från överskott av calmodulin.

Flödescellsberedning. Flödescellen konstruerades med ett glasmikroskopglas och starkt brytande täckglas av NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) som hölls samman av bitar dubbelhäftande Scotch-tejp.

För myosin V-experimenten inkuberades 15 μl biotin-BSA (1 mg-ml-1) i flödescellen i 2 minuter, varefter 30 μl AB-buffert (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg-ml-1 BSA) passerade genom flödescellen för att tvätta ut den. Femton mikroliter 0,5 mg/ml NeutrAvidin (Molecular Probes) tillsattes till cellen och fick inkubera i 2 minuter, varefter ytterligare en tvätt gjordes med AB-buffert. Flödescellen inkuberades med 15 μl biotinylerade phalloidin-aktinfilament (250 nM) i 5 min, följt av en 100-μl tvätt med AB-buffert. Slutligen laddades cellen med 20 μl av avbildningsbuffert med calmodulinutbytt myosin V, 5 μM calmodulin, 300 nM ATP, ett ATP-regenereringssystem (0,1 mg-ml-1 kreatinfosfokinas/1 mM kreatinfosfat) och 0,5 % (vol/vol) Triton-X 100 för att minska ospecifik bindning. Cellen förseglades med vakuumfett och avbildades omedelbart. Den slutliga motorkoncentrationen resulterade i sparsamt dekorerat aktin och möjliggjorde därmed en analys av enskilda myosin V-molekyler.

För DNA-experimenten laddades biotin-BSA och NeutrAvidin på samma sätt som för myosin V-experimenten, men tvättarna gjordes med T50-buffert (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). När flödescellen hade en NeutrAvidin-beläggning flödade 15 μlof dsDNA (30 nM) i T50-buffert med 1 mg-ml-1 BSA in och inkuberades i 2 minuter, varefter 100 μl avbildningsbuffert flödade in. Flödescellen förseglades sedan med vakuumfett och avbildades snabbt. Den resulterande dekorationen av DNA-molekyler på ytan var tillräckligt gles att fluorescerande fläckar från olika molekyler sällan överlappade varandra.

Mikroskopuppställning. TIRF-mikroskopet (total internal reflection fluorescence) sattes upp enligt beskrivningen i ref. 8, med vissa ändringar (fig. 5, som publiceras som stödinformation på PNAS-webbplatsen). Excitationskällor vid 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) och 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) kombinerades med en dikroisk spegel och expanderades till en diameter på 7 mm. Dessa källor fokuserades (brännvidd = 500 mm) på det bakre fokalplanet på ett Olympus 1,65 NA ×100 TIRF-objektiv med hjälp av en dikroisk laserlinje på en linjär DeepL translation som gör det möjligt att använda mikroskopet i antingen epifluorescens- eller TIRF-läge. Objektivet placerades under en tvåaxlig piezo nanoDeepL-translation med sluten loop, utrustad med kapacitiva sensorer för lägesmätning (Physik Instrumente, Auburn, MA). Det reflekterade ljuset från objektivets bakre öppning riktades mot en kvadrantfotodiod för att ge en signal till en fokusåterkopplingsslinga som spänner avståndet mellan objektivet och provet med en elektrostriktiv manöverdon (Newport, Fountain Valley, CA). Fluorescensutsläpp samlades in av objektivet, leddes genom två StopLine tunnfilmsfilter (Semrock, Rochester, NY), ett för varje excitationskälla, och överfördes genom en apparat med dubbla vyer som möjliggjorde samtidig avbildning av Cy3- och Cy5-kanalerna på en enda iXon DV 887 EMCCD-kamera (Andor Technology, Belfast, Irland). Alla data avbildades med en integrationstid på 0,5 sekunder. Överhörning mellan de två kanalerna (10 %) förvränger antagligen avståndsmätningarna mot mindre värden. Vårt experimentella fel gör det dock omätbart, vilket visas av Monte Carlo-simuleringar där 100 par modellerade bilder av enskilda fluorophorer separerade med 10 nm skapades och analyserades på samma sätt som med DNA-data (beskrivs nedan). Simulerade bilder av fluorescerande punktspridningsfunktioner beräknades genom att generera en integrerad 2D-gaussisk intensitetsfördelning med en konstant bakgrund till vilken skottbrus lades till. De simulerade topparna hade samma dimensioner och signal-brusförhållande som de verkliga topparna. Simulerade data med 10 % crosstalk och simulerade data utan crosstalk kan inte särskiljas genom ett Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Dataanalys. En registreringskartläggning av Cy3- och Cy5-kanalerna utfördes med fiducials bestående av 100 nm TransFluoSphere-pärlor (Molecular Probes). De exciterades vid 532 nm och emitterar med ett brett emissionsspektrum. Pärlan var detekterbar i båda våra kanaler. Vi placerade en enda pärla i anslutning till täckglaset, och med vårt piezoskåp stegade vi den med nanometerprecision i ett rutmönster (med 0,5 μm mellanrum) och tog en bild vid varje stopp. Slutresultatet blev en stapel av 312 bilder som visar pärlan i båda kanalerna i olika positioner (fig. 1a ).