PMC

LÖSNINGARNA OM FÖRBÄTTRADE TERAPIER GENOM MOLECULÄR STUDIE AV FETAL HEMOGLOBINREGLERING

Och även om de icke-målinriktade terapeutiska metoderna som diskuterats ovan har visat sig vara lovande och har haft en viss framgång när det gäller att framkalla HbF i kliniska situationer, En förbättrad mekanistisk förståelse av de molekylära underlag som är nödvändiga för det normala bytet av hemoglobin från foster till vuxen är mycket lovande för att möjliggöra utveckling av effektivare och mer specifikt riktade metoder för induktion av HbF. Under decennierna efter den molekylära kloningen av globingenerna identifierades en rad transkriptionsfaktorer som spelade en roll i globingens reglering (Cantor och Orkin 2002). Detta inkluderade transkriptionsfaktorer som GATA1, KLF1 och SCL/ TAL1. Att studera dessa faktorers roll i globingens reglering försvårades dock av dessa faktorers breda roll i differentiering och deras pleiotropa roller som regulatorer av globin- och erytroida genreglering. Ingen av dessa faktorer verkade vara specifika regulatorer av övergången från foster till vuxen hemoglobin. Det tog nästan tre decennier från den första kloningen av globingenerna innan specifika regulatorer av denna process skulle identifieras.

Betydelsefulla ledtrådar till identiteten av sådana faktorer kom från studiet av naturlig mänsklig genetisk variation. Ett antal grupper sökte efter grunden för gemensam genetisk variation i HbF-nivåer med hjälp av både riktade och genome-wide association studies (GWAS) (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Dessa studier resulterade i identifiering av tre genomiska loci med vanliga varianter som påverkade HbF-nivåerna. Det rörde sig om en region på kromosom 2 inom BCL11A-genen, en intergenisk region mellan generna HBS1L och MYB på kromosom 6 och varianter inom β-globinlocus på kromosom 11. Nya studier som har kartlagt dessa genetiska varianter mer noggrant tyder på att >50 % av variationen i HbF-nivåer kan förklaras av gemensam variation vid dessa tre loci (Galarneau et al. 2010). Även om HbF-nivåerna antas ha en ärftlig genetisk komponent i storleksordningen ∼80 % är det viktigt att komma ihåg att den additiva genetiska variationen som hittas från gemensamma genetiska varianter ignorerar potentiella genetiska interaktioner av högre ordning som kanske inte upptäcks, och därför återstår att utforska i vilken utsträckning HbF-nivåerna är genetiskt betingade i framtida studier (Zuk et al. 2012).

Den första observationen av varianter som är associerade med HbF-nivåer inom zinkfinger-transkriptionsfaktorn BCL11A ledde till en första studie som följde hypotesen att BCL11A kan vara en regulator av HbF-uttrycket (Sankaran et al. 2008). Tidigare arbete hade föreslagit att BCL11A var en kritisk transkriptionsregulator som var involverad i B-lymfopioes och neurogenes (Sankaran et al. 2010). BCL11A-proteinnivåerna tycktes korrelera med utvecklingsstadiet för uttrycket, så att primitiva och fosterleverns definitiva erytroida celler som uttryckte höga nivåer av γ-globin, hade lågt eller inget uttryck av de fullständiga formerna av BCL11A. Detta resultat tyder på att denna genprodukt agerar som en repressor av γ-globingenerna. För att direkt testa detta utfördes knockdown av BCL11A med hjälp av shRNA-metoder (short-hairpin RNA) i primära vuxna erytroida progenitorer, och γ-globinuttrycket kunde induceras kraftigt vid en sådan knockdown. Graden av γ-globininduktion verkade vara relaterad till omfattningen av knockdown av BCL11A. Intressant nog tycktes det inte förekomma några större störningar i erytropoesen trots den kraftiga γ-globininduktionen. Uppföljningsstudier har visat liknande resultat när man slår ner uttrycket av BCL11A med hjälp av shRNA (Borg et al. 2010; Zhou et al. 2010; Wilber et al. 2011). Det visades dessutom att BCL11A interagerar direkt med kromatin vid det humana β-globinlocuset i primära erytroida celler och att det verkade agera som en del av ett komplex med transkriptionsfaktorn GATA1 och kromatinremodellerings- och repressorkomplexet NuRD (Sankaran et al. 2008). Av intresse är att NuRD-komplexet innehåller HDAC 1 och 2, som har föreslagits vara de kritiska HDAC:er som är nödvändiga för att HbF ska kunna tystas (Bradner et al. 2010). Dessutom har det föreslagits att transkriptionsfaktorn SOX6 kan samarbeta med BCL11A för att hjälpa till att tysta γ-globingenerna hos människor och att den kan vara nödvändig för att binda den proximala promotorn för dessa globingener (Xu et al. 2010).

Och även om hemoglobinväxling i musmodeller, även de som bär en transgen från ett humant β-globinlocus, tycks avvika från den normala ontogeni av globinuttryck som ses hos människor, visades en evolutionärt bevarad roll för BCL11A i tystnad och växling av globingener hos möss (Sankaran et al. 2009; McGrath et al. 2011). Möss som saknar BCL11A verkar ha normal erytropoes, men misslyckas med att helt tysta de embryonala globingenerna i definitiva erytroida celler och tillåter ett visst ihållande uttryck av γ-globin när det intakta humana β-globinlocuset är närvarande. Dessa resultat förstärker betydelsen av BCL11A som en kritisk mediator för globinbyte hos däggdjur. Även om denna första studie behandlade BCL11A:s roll i utvecklingsprocessen för globinväxling hos möss (Sankaran et al. 2009), användes i en nyare studie villkorlig inaktivering av BCL11A för att visa att inducerbar inaktivering kan resultera i en robust och likartad omfattning av γ-globin-geninduktion som inträffar när inaktiveringen sker vid tidigare tidpunkter (Xu et al. 2011). Även om det finns en differentiell reglering av globingenerna mellan människor och möss, visade det sig dessutom att inaktivering av BCL11A var tillräcklig för att förbättra de hematologiska och patologiska egenskaper som ses i musmodeller av sicklecellsjukdom, vilket ger ett viktigt principbevis för den potentiella effekten av att rikta in sig på BCL11A för att inducera HbF (Xu et al. 2011).

De exakta mekanismerna genom vilka BCL11A tystar γ-globin-genuttrycket är fortfarande oklara. En nyligen genomförd studie tyder på att detta kan förmedlas både genom interaktioner med transkriptionsfaktorer, såsom SOX6 som binder kromatin vid de proximala γ-globin-promotorerna, och genom långväga interaktioner med en mängd olika regioner i hela β-globin-genklustret (Xu et al. 2010). När BCL11A saknas förändras konformationen av β-globinlocus så att den uppströms enhancer som är känd som locus control region ligger bredvid de transkriptionellt aktiverade γ-globingenerna. Ett liknande fenomen uppstår när celler behandlas med HDAC-hämmare som inducerar γ-globin-genuttryck (Bradner et al. 2010). Det är dock oklart om dessa konformationsförändringar förmedlas direkt av BCL11A eller om dessa förändringar sker sekundärt till den HbF-inducerande effekten av BCL11A- (eller HDAC-) hämning. Icke desto mindre stöder dessa resultat starkt uppfattningen att BCL11A tycks ha en direkt roll i tystandet av γ-globinuttrycket inom β-globinlocus. Genom att kartlägga en mängd olika deletioner inom det humana β-globinlocus som antingen resulterar i δβ-thalassemi, med blygsamma ökningar av HbF och viss kvarvarande obalans i globinkedjorna närvarande, eller HPFH, med robusta ökningar av HbF och balanserad globinkedjesyntes, visades att en N3-kb-region uppströms δ-globingenen är nödvändig för att γ-globingenerna ska kunna tystas (fig. 2) (Sankaran et al. 2011c). Intressant nog har denna region bindningsställen för BCL11A, tillsammans med dess partners som GATA1 och HDAC1. Det är värt att notera att denna region också oberoende av varandra har involverats som viktig för γ-globinsilens genom studier av Corfu thalassemia-deletionen hos människor (Chakalova et al. 2005). Denna studie ger viktiga mekanistiska insikter om hur BCL11A fungerar för att tysta HbF och förstärker betydelsen av naturliga mänskliga mutationer för att förstå denna utvecklingsprocess som är unik för människan (Fig. 2) (Sankaran et al. 2011c).

Med tanke på dessa fynd är det troligt att BCL11A är ett viktigt terapeutiskt mål. Det faktum att dess inaktivering inducerar HbF utan att resultera i en större störning i erytropoesin är mycket lovande, även om det är känt att det har viktiga effekter i andra linjestrukturer, t.ex. B-lymfocyter, vilket understryker betydelsen av in vivo-modellering och -analys som en del av de pågående insatserna för att rikta in BCL11A för HbF-induktion. Ytterligare studier som utforskar de verkningsmekanismer genom vilka BCL11A fungerar kan leda till bättre och mer specifikt riktade tillvägagångssätt för HbF-induktion (Sankaran et al. 2011c). SOX6 kan också vara en potentiellt lovande måltavla för HbF-induktion (Xu et al. 2010), även om det är känt att den är nödvändig för normal erytropoes (Dumitriu et al. 2006). En patient har dock rapporterats med en heterozygot störning av SOX6 som inte hade förhöjda HbF-nivåer, vilket tyder på att SOX6-genen kan ha en mekanism för doskompensation eller att det kan finnas ett särskilt tröskelvärde som krävs för att minska uttrycket av denna gen för att få en robust HbF-induktion (Sankaran et al. 2011a). Detta tyder på att det kan finnas begränsningar i att betrakta SOX6 som ett potentiellt mål för HbF-induktion.

Efter de inledande studierna om BCL11A föreslog två studier att uttrycket av BCL11A tycks kontrolleras av den erytroida specifika transkriptionsfaktorn KLF1 med hjälp av oberoende och kompletterande metoder. I den ena studien resulterade en mus med en hypomorf allel av KLF1 i förhöjda uttryck av embryonalt globin och transgena möss med det humana β-globinlocet visade ett ihållande uttryck av γ-globin (Zhou et al. 2010). Som ett resultat testade forskarna om samma reglering kunde ske i primära mänskliga erytroida celler och kunde visa ett liknande samband med hjälp av shRNA-metoder. Forskarna visade sedan att denna effekt sker både genom direkta effekter av KLF1 vid β-globinlocus, men också via indirekta effekter som förmedlas genom minskat uttryck av BCL11A vid knockdown av KLF1. Detta resultat visade att KLF1 var en direkt positiv transkriptionsregulator av uttrycket av BCL11A. En andra grupp undersökte den genetiska grunden för en obunden form av HPFH som föreslogs bero på en KLF1-missense-mutation i denna familj (Borg et al. 2010). Forskarna kunde med hjälp av primära celler från dessa patienter och från opåverkade kontroller visa att den effekt man såg delvis berodde på en tystande effekt av KLF1 på BCL11A. Ett område med fortsatt osäkerhet gäller de mänskliga fenotyper som ses med olika fall av KLF1-mutationer. Även om alla mottagare av missense-mutationen i den första rapporten hade förhöjda HbF-uttryck bör det noteras att detta faktiskt varierade mellan 3 % och 19 % av de totala hemoglobinnivåerna. Dessutom visar andra rapporter om heterozygota KLF1-mutationer hos människor antingen en samtidig störning av erytropoesin eller en liten effekt på HbF-uttrycket (Arnaud et al. 2010; Satta et al. 2011). Nyare studier tyder på att sällsynta varianter i KLF1 faktiskt är förknippade med förhöjningar av HbF, men detta verkar inte ske konsekvent eller i samma utsträckning även med liknande mutationer (Gallienne et al. 2012). Grunden för denna variation återstår att fastställa och kommer att vara viktig för att bättre förstå de mekanismer genom vilka KLF1 verkar både direkt och indirekt för att påverka HbF-uttrycket. Detta kommer att vara avgörande för allt framtida arbete där man försöker rikta in KLF1 för HbF-induktion, särskilt om de oönskade effekterna av en sådan hämning på erytroid differentiering ska undvikas. Med tanke på KLF1:s specificitet inom den erytroida linjen och om KLF1:s globingeneregulerande aktivitet skulle kunna riktas specifikt mot KLF1, bör KLF1 ändå betraktas som en kandidat för att inducera HbF.

Inom de vanliga genetiska varianter som identifierats i BCL11A och som är associerade med HbF-nivåer hos människor, visade GWAS-studierna att det fanns varianter på kromosom 6 intergeniska mellan generna HBS1L och MYB som tycks ha en dramatisk effekt på HbF-nivåerna hos människor (Menzel et al. 2007; Thein et al. 2007; Lettre et al. 2008; Uda et al. 2008). Det är viktigt att förstå den verkningsmekanism genom vilken dessa varianter resulterar i förändringar i HbF-nivåerna, eftersom de genetiska varianterna på detta locus verkar ha lika stor eller kanske till och med större effekt på den kliniska morbiditeten i β-hämoglobinopatier som de varianter som finns på BCL11A-lokuset (Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010). Intressant nog innehåller denna region en mängd olika regleringselement som har föreslagits ha en viktig roll i regleringen av uttrycket av MYB i erytroida progenitorer (Mukai et al. 2006; Wahlberg et al. 2009; Stadhouders et al. 2011). Även om överuttryck av HBS1L inte tycktes påverka γ-globinuttrycket i K562 erytroleukemiceller, tycktes överuttryck av MYB påverka nivån av γ-globin som produceras i dessa celler (Jiang et al. 2006). Dessutom hade kulturer av primära erytroida progenitorer från människor med högre uttryck av HbF oftare minskat uttryck av MYB (Jiang et al. 2006).

För att följa upp den klassiska kliniska observationen att patienter med en trisomi av kromosom 13 har en försenad övergång från foster till vuxen hemoglobin och fortsätter att ha ett ihållande uttryck av HbF (Huehns et al. 1964; Sankaran och Sapp 2012), har nyligen genomförda studier gett ytterligare bevis för att MYB spelar en roll i regleringen av HbF-uttrycket. Genom att finkartlägga och utföra integrativ genomisk analys av gener i en region på kromosom 13 som impliceras som nödvändig för den höjning av HbF som ses hos patienter med partiella trisomier på kromosom 13, fann man att det fanns två små ∼22-nukleotid-RNA-molekyler som var toppkandidater för att utföra en sådan aktivitet, mikroRNA 15a och 16-1 (Sankaran et al. 2011b). Övexpression av dessa mikroRNAs i primära vuxna erytroida celler i kultur resulterade i ökad γ-globinproduktion. Genom att undersöka dessa mikroRNAs måltavlor noterades det att en viktig måltavla i erytroida celler var MYB. Direkt knockdown av MYB i primära vuxna erytroida progenitorer resulterade i dramatiska ökningar av γ-globinproduktionen (Sankaran et al. 2011b), vilket kopplar samman denna historiska observation från ett sällsynt mänskligt aneuploidiesyndrom med det nyare arbetet med att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar HbF-nivåerna.

Mekanismen genom vilken MYB kan verka för att reglera HbF-nivåerna är fortfarande oklar. Detta kan bero på en effekt på erytropoesins kinetik eller alternativt kan det också ske som ett resultat av en direkt effekt inom β-globinlocus (Higgs och Wood 2008). Ytterligare arbete kommer att vara nödvändigt för att utforska sådana mekanismer och är mycket lovande för försök att terapeutiskt rikta denna molekyl mot HbF-induktion. Det finns en oro för att målinriktning av MYB skulle kunna få oönskade bieffekter, särskilt med tanke på MYB:s pleiotropa roll i hematopoiesen (Emambokus et al. 2003; Carpinelli et al. 2004). Nya arbeten tyder dock på att sådana strategier faktiskt kan vara lovande, eftersom partiell knockdown av Myb hos möss hade liten effekt på normal hematopoesi in vivo samtidigt som den dramatiskt blockerade utvecklingen av leukemier (Zuber et al. 2011a). Därför kan partiell hämning av MYB vara lovande som en värdefull strategi för HbF-induktion. Den additiva effekten av varianter i den intergena HBS1L-MYB-regionen tillsammans med varianter på BCL11A-lokusen (Lettre et al. 2008; Galanello et al. 2009; Nuinoon et al. 2010) antyder att en inriktning på båda dessa vägar tillsammans skulle kunna ge ännu mer robusta effekter än en inriktning på någon av vägarna ensam.

Och även om de regulatorer av HbF-regleringen som diskuteras ovan har hittats genom humangenetiska studier, vilket bekräftar deras relevans in vivo hos människor, har en mängd andra molekyler också föreslagits spela en roll i regleringen av γ-globingenen genom olika studier med hjälp av cellodlingsmetoder eller med musmodeller (tabell 1). Dessa molekyler kommer att diskuteras nedan. Det är viktigt att komma ihåg att det finns begränsningar för de flesta av de för närvarande tillgängliga experimentella system som används för att studera γ-globingens reglering. Primära erytroida celler från människa tycks vara tillåtande för manipulationer som gör det möjligt att öka γ-globinproduktionen, vilket kanske inte alltid är relevant för människor in vivo. Dessutom fungerar många av de stimuli som är kända för att inducera γ-globinproduktion in vivo hos människor, inklusive olika typer av stresserytropoesi och behandling med hydroxyurea, inte för att inducera γ-globinproduktion i humaniserade musmodeller (Pace et al. 1994; Sankaran et al. 2009) vilket understryker en viktig begränsning för att tolka negativa resultat i detta experimentella system. Därför måste man vara försiktig när man tolkar experimentella resultat som inte stöds av bevis från humangenetiska studier eller studier utförda på människor eller primater in vivo.

Genom att undersöka proteiner som binder till de direkt upprepade element som finns i promotorn för γ-globingenerna, har de föräldralösa kärnhormonreceptorerna TR2 och TR4 föreslagits spela en roll som repressorer av uttrycket av γ-globingenerna (Tanabe et al. 2002, 2007; Cui et al. 2011). Paradoxalt nog resulterar överuttryck av TR2 och TR4 i transgena musmodeller i ett förhöjt uttryck av γ-globin och när de överuttrycks i musmodeller för sicklecellsjukdom kan det resultera i en partiell förbättring av de hematologiska och patologiska symtomen hos dessa möss (Campbell et al. 2011). De mekanismer som ligger till grund för dessa observationer och relevansen för reglering av globingener hos människor återstår att fastställa för TR2 och TR4. Dessutom har kärnreceptorn COUP-TFII, som är ett särkilt kärnhormon, också föreslagits binda till de direkta upprepningarna och reprimera γ-globinpromotorn hos människor (Filipe et al. 1999). Med hjälp av in vitro-odlingar av primära vuxna erytroida celler visades att cytokiner som SCF verkar nedreglera uttrycket och kromatinbeläggningen av COUP-TFII vid β-globinlocus, vilket resulterar i ökat γ-globinexpression (Aerbajinai et al. 2009). Dessutom kan direkt nedreglering av COUP-TFII med hjälp av små interfererande RNA (siRNA) leda till ökad γ-globinproduktion (Aerbajinai et al. 2009). Ytterligare studier om COUP-TFs roll i regleringen av HbF kommer att behövas för att bättre förstå dess fysiologiska roll hos människor.

Nyligen genomförda studier har också föreslagit en roll för genen som kallas friend of PRMT1 (FOP1) i repressionen av γ-globin genuttryck (van Dijk et al. 2010). Knockdown av FOP1 resulterar i förhöjt HbF-uttryck i mänskliga vuxna erytroida celler i kultur. Det föreslogs att detta förmedlades genom minskat uttryck av SOX6, vars knockdown också är känt för att resultera i ökad γ-globinproduktion (Xu et al. 2010). Ytterligare arbete kommer att behövas för att bekräfta dessa resultat, förstå om denna gen också har en roll i erytropoesin mer allmänt och undersöka den mekanism som ligger till grund för dessa observationer.

En del studier har också föreslagit en roll för det stadieselekterande proteinet NF-E4 som en aktivator för γ-globinuttryck hos människor (Jane et al. 1995; Zhao et al. 2006). Det har föreslagits att en kort form av NF-E4 kan ha en roll i att undertrycka γ-globingenerna genom att hämma den normala aktiverande funktionen hos NF-E4 vid promotorn för dessa gener (Zhou et al. 2004). Dessa studier har alla baserats på experiment som utförts i odlade celler och biokemisk rening av proteinkomplex från K562-celler och därför kommer ytterligare arbete att behövas för att bekräfta den fysiologiska rollen för denna gen i γ-globinuttrycket och för att bättre förstå de mekanismer genom vilka detta komplex kan verka för att förändra regleringen av humana globingener.