Mechanismus syntézy DNA

Od Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Recenzovala Hannah Simmons, M.Sc.

Kopírování receptu života

DNA neboli deoxyribonukleová kyselina je biologická molekula, která obsahuje informace potřebné k vytvoření živého organismu. Když se buňka rozdělí na dvě, musí se DNA zkopírovat, aby obě buňky obsahovaly potřebnou genetickou informaci. Syntéza neboli vytváření nových vláken DNA v živých buňkách se označuje jako „replikace DNA“.

Replikace DNA. Obrázek: Designua /

Vytváření nového vlákna DNA

DNA se vyskytuje jako dvojitá šroubovice, kde jsou dvě vlákna DNA spojena do dvou šroubovic. Proces replikace DNA začíná, když se obě vlákna DNA oddělí. Enzym zvaný helikáza odvíjí a odděluje vazby mezi oběma vlákny DNA a obě tato oddělená vlákna slouží jako šablony, z nichž se vytváří nová DNA.

Polymerázy DNA jsou skupinou enzymů, které vytvářejí novou DNA. Aby však tento enzym mohl pracovat, potřebuje primer – krátkou sekvenci nukleotidů, která je připojena k jednomu z jednotlivých vláken DNA. Při replikaci DNA je primerem obvykle krátká sekvence ribonukleové kyseliny (RNA), která je později rozložena a nahrazena DNA.

Primer poskytuje 3′ hydroxylovou skupinu, na kterou polymeráza DNA přidává prekurzory DNA, nukleotidy. Při přidávání nukleotidů na 3′ konec primeru nebo nového vlákna DNA vzniká vazba mezi 3′ hydroxylovou skupinou primeru/nové DNA a 5′ fosfátovou skupinou nukleotidu.

Existují čtyři typy nukleotidů DNA, z nichž každý má jiné dusíkaté báze: adenin (A), cytosin (C), guanin (G) a tymin (T). Ty se vždy nacházejí v párech, A-T a C-G. Toto párování se označuje jako „Watson-Crickovo párování bází“, a proto pokud je v templátu nukleotid „A“, pak se do rostoucího vlákna DNA přidá nukleotid „T“. Pokud je to nukleotid „G“, pak se do rostoucího vlákna přidá nukleotid „C“.

Směrovost DNA a její vliv na syntézu DNA

DNA má směrovost, přičemž jedno vlákno jde od 5′ k 3′ a druhé od 3′ k 5′. U 5′-3′ vlákna je při syntéze nové DNA obnažen 3′ konec. To znamená, že DNA polymeráza je schopna vytvářet novou DNA ve směru templátové DNA.

Když však jde o 3′-5′ stadium, zůstal by 5′ konec obnažený; jak se s tím DNA polymeráza vypořádá? Ve 3′-5′ vlákně vzniká nová DNA tak, že DNA polymeráza vytváří krátké 5′-3′ fragmenty, které se nazývají Okazakiho fragmenty. Pak jiný enzym, DNA ligáza, spojí Okazakiho fragmenty dohromady a vytvoří nové 3′-5′ vlákno DNA.

Proof-Reading

Při přidávání nukleotidů na templátové vlákno DNA někdy dochází k chybám. Některé DNA polymerázy mají tzv. 3′-5′ exonukleázovou aktivitu. Aktivita 3′-5′ exonukleázy, která působí proti aktivitě polymerázy nebo syntézy, odřezává nukleotidy, které neodpovídají templátu. Tím je zajištěno korekturní čtení, aby nové vlákno DNA bylo co nejpřesnější.

Jak se toho využívá v molekulární biologii?

Vlastnosti syntézy DNA byly využity v různých technikách molekulární biologie; polymerázové řetězové reakci (PCR) a sekvenování DNA.

Polymerázová řetězová reakce

PCR je technika vyvinutá v 80. letech 20. století k amplifikaci určité části DNA. Primery DNA jsou navrženy tak, aby pokrývaly oblast zájmu. Teplem se oddělí dvě vlákna DNA a poté se sníží teplota, aby se primery mohly navázat na DNA. Tepelně stabilní polymeráza DNA pak vytvoří nová vlákna DNA odpovídající zájmové oblasti přidáním nukleotidů na 3′ konec primerů.

Sekvenování DNA

Sekvenování DNA je zjištění pořadí bází (A, C, G, T), které se nacházejí v DNA. Sangerovo sekvenování je jednou z prvních technik sekvenování DNA, při níž je syntéza DNA zastavena. To je umožněno odstraněním hydroxylové skupiny z 3′ konce nukleotidů, proto když jsou tyto „dideoxy nukleotidy“ začleněny do vlákna DNA, nemůže polymeráza DNA přidat další nukleotid. Tyto dideoxynukleotidy se mísí s nukleotidy, proto vznikají fragmenty různé délky. Tím, že dideoxy-A, dideoxy-C, dideoxy-G a dideoxy-T probíhají v samostatných reakcích, lze určit poslední nukleotid fragmentu. Po oddělení podle velikosti lze pak sekvenci DNA určit tak, že se podíváme, jaký je poslední nukleotid fragmentů podle velikosti.

Ačkoli moderní metody sekvenování DNA jsou automatizované a méně pracné než Sangerovo sekvenování, existují některé, které vychází ze Sangerova sekvenování; například ke každému dideoxy-nukleotidu lze přidat různá fluorescenční barviva a rozdíly detekovat pomocí různých fluorescenčních barev.

Further Reading

• All DNA Content
• What is DNA?
• Vlastnosti DNA
• Chemické modifikace DNA
• Biologické funkce DNA

Napsal

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama je vědecký pracovník a autor vědeckých článků. Doktorát získala na univerzitě v Bathu ve Velké Británii na základě disertační práce v oboru mikrobiologie, kde aplikovala funkční genomiku na Staphylococcus aureus . Během doktorského studia Maho spolupracovala s dalšími vědeckými pracovníky na několika pracích a některé své vlastní práce dokonce publikovala v recenzovaných vědeckých časopisech. Svou práci také prezentovala na vědeckých konferencích po celém světě.

Citace

.