5.5.9 Trikarboxylový cyklus
Pyruvát se nachází na větvi katabolické sekvence oxidativního metabolismu glukózy v TCA cyklu a glukoneogenní dráhy z C3 prekurzorů. V obou drahách vstupuje pyruvát do TCA cyklu, kde je buď oxidativně dekarboxylován na acetyl-CoA prostřednictvím pyruvátdehydrogenázy, nebo karboxylován na oxaloacetát v reakci pyruvátkarboxylázy. Vzhledem k tomu, že PC a PDH soutěží o pyruvát, mají klíčové postavení pro regulaci anaplerotického (tj. doplňujícího), resp. oxidačního metabolismu. Cohen a spolupracovníci (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) použili kombinace značeného a neznačeného alaninu nebo pyruvátu a ethanolu ke zkoumání konkurence jaterních substrátů při vstupu do TCA cyklu za různých hormonálních a dietních stavů perfundovaných jater potkanů a myší.
Když byl alanin jediným jaterním substrátem, byly C2, C3 a C4 glutamátu a glutaminu snadno značeny, jak se očekávalo z topologie TCA cyklu (Cohen et al., 1979b; Cohen, 1987a). Alanin je transaminován na pyruvát, který je buď dekarboxylován na acetyl-CoA, nebo karboxylován na oxaloacetát. Acetyl-CoA je začleněn do citrátu a následně do α-ketoglutarátu, který může být transaminován na glutamát. Na druhé straně je oxaloacetát v rovnováze s malátem a fumarátem (viz oddíl 5.5.8) a značka je zakódována do C2 a C3 oxaloacetátu. Kondenzací těchto isotopomerů oxaloacetátu s acetyl-CoA v reakci citrát syntázy následně vznikají – a α-ketoglutarát, a tedy – a glutamát. Relativní podíl pyruvátu vstupujícího do TCA cyklu prostřednictvím PC a PDH lze tedy odhadnout podle relativního obohacení glutamátu C2 a C4. Za předpokladu modelu prvního řádu, kdy se uvažuje pouze jedna otočka TCA cyklu a zanedbává se kontinuální recyklace značky (viz oddíl 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) vypočítal poměry rychlosti toku PC versus PDH, které se pohybovaly od 1,2 do 2,6 a 7,7 v játrech dobře živených, diabetických a 24 hodin hladovějících dárcovských potkanů. V diabetických játrech se relativní podíl pyruvátu směrovaného do TCA cyklu oběma alternativními cestami inkubací s inzulinem nezměnil.
Na rozdíl od experimentů, kde byl jediným substrátem jaterního metabolismu alanin, vedlo současné přidání neznačeného ethanolu ke glutamátu C4 a glutaminu C4 v podstatě bez značení (Cohen et al., 1979b). Ethanol, který je snadno oxidován alkoholdehydrogenázou na acetaldehyd a poté dále na acetát, slouží jako další zdroj acetyl-CoA. Výsledky ukázaly, že acetyl-CoA získaný z ethanolu účinně konkuruje acetyl-CoA vstupujícímu do TCA cyklu prostřednictvím PDH. V přítomnosti alternativního zdroje acetyl-CoA tedy alanin vstupoval do TCA cyklu téměř výhradně prostřednictvím PC reakce. Kromě toho se při spolupodávání alaninu s ethanolem zvýšila rychlost spotřeby alaninu prostřednictvím PC reakce téměř o 50 % ve srovnání s játry perfundovanými pouze alaninem. Tento výsledek není neočekávaný vzhledem k PC reakci, která je regulována hladinou acetyl-CoA. Zvýšená koncentrace acetyl-CoA, která byla k dispozici při metabolismu ethanolu, zvýšila tok přes PC, aby se zvětšil pool oxaloacetátu pro zrychlenou spotřebu acetyl-CoA v TCA cyklu. Podobné experimenty byly provedeny se značeným pyruvátem + NH4C1 a ethanolem jako substráty a poskytly rovnocenné výsledky (Cohen, 1987a,b). Dále Nedelec et al. (1990b) použili model navržený Cohenem (1983) pro posouzení vlivu virem indukované myeloproliferativní leukémie na jaterní metabolismus. Bylo zjištěno, že metabolismus alaninu v infikovaných játrech dárců, kteří byli nalačno, je podobný jako u kontrol, které byly krmeny. Játra obou skupin měla snížený podíl PC oproti PDH na toku alaninu do TCA cyklu ve srovnání s kontrolními hladovějícími. Změněný poměr toku PC/PDH v leukemických játrech nalačno byl vysvětlen drasticky sníženou dostupností triglyceridů, a tedy i acetyl-CoA v těchto orgánech.
13C MRS nabízí jedinečnou možnost sledovat metabolismus etanolu a alaninu současně (viz obrázek 8). V experimentech, kde byly jako zdroje uhlíku použity alanin a ethanol, vznikl acetyl-CoA se dvěma různými vzorci značení (Cohen, 1987b). Při vstupu alaninu do TCA cyklu prostřednictvím reakce PDH vzniká acetyl-CoA a acetyl-CoA je odvozen z ethanolu. Kromě značení citrátu, α-ketoglutarátu, glutamátu a glutaminu v polohách C4 a C5 vzniká při inkorporaci acetyl-CoA typická spinová vazba mezi sousedními uhlíky C4 a C5 glutamátu a glutaminu, která je snadno odlišitelná od singletových rezonancí vzniklých inkorporací alaninu. Proto lze přímý odhad konkurence mezi alaninem a ethanolem získat z analýzy poměru singletů a multipletů v C4 glutamátu. Analýza spinových vazebných vzorců byla rovněž užitečná pro přiřazení rezonancí glutathionu pozorovaných v 13C MR spektrech získaných z perfundovaných jater (Cohen, 1987a). Vzorce spinové vazby zjištěné pro glutamylovou část v glutathionu při perfuzi jater prekurzory značenými 13C úzce odpovídaly vzorcům značení pozorovaným u glutamátu. Proto byl učiněn závěr, že uhlíková kostra glutamátu zůstala neporušená a byla přímo začleněna do de novo syntetizovaného glutathionu. Chemické posuny naměřené v extraktech PCA z jater ukázaly, že glutathion je přítomen ve své redukované formě.
Kromě glutamátu bylo v mnoha experimentech pozorováno značení jaterního glutaminu. To není překvapivé, protože glutamin se snadno tvoří v glutamin syntetázové reakci. Cohen et al. (1979b) sledovali časový průběh inkorporace značek do jaterního glutamátu a glutaminu v myších játrech perfundovaných v přítomnosti alaninu a značeného nebo neznačeného ethanolu. Za všech zkoumaných podmínek se obohacení glutaminu zpožďovalo za obohacením glutamátu, jak dokládá poměr C4/C2 intenzity signálu 13C MR v glutamátu a glutaminu. Poměr C4/C2 pozorovaný v glutaminu v daném čase nebyl stejný jako odpovídající poměr v glutamátu, ale odrážel poměr glutamátu přibližně o 1 hodinu dříve. Tento časový rozdíl byl použit jako míra toku přes alostericky řízenou reakci glutamin syntázy in vivo. Podobné výsledky byly získány z jater potkanů perfundovaných acetátem (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Interpretace značení v glutamátu a glutaminu však byla provedena o krok dále. Autoři předpokládali, že glutamát a glutamin se mohou účastnit marného cyklu, který zahrnuje aktivity cytosolické glutamin syntázy, mitochondriální glutaminázy a výměny glutamátu/glutaminu přes mitochondriální membrány.
V játrech na lačno perfundovaných alaninem a ethanolem nebo pyruvátem, chloridem amonným a ethanolem lze pozorovat aspartát a N-karbamoylaspartát značený na C2 a C3 (Cohen, 1987a). Detekce značeného aspartátu není neočekávaná, protože se snadno tvoří transaminací meziproduktu TCA cyklu oxaloacetátu. N-karbamoylaspartát však vzniká v játrech v jednom z prvních kroků syntézy pyrimidinových nukleotidů de novo. N-karbamoylaspartát obsahuje neporušenou aspartátovou část, což vede k pozorovanému způsobu značení. Další detekce značení 13C v koncových produktech dráhy, jako je uridin a jeho produkty fosforylace, naznačuje, že v perfundovaných játrech byla pozorována čistá syntéza N-karbamoylaspartátu, na rozdíl od obratu (Cohen, 1987a).
.