5.5.9 O Ciclo do Ácido Tricarboxílico
Pyruvate está no ponto de ramificação da sequência catabólica do metabolismo da glicose oxidativa no ciclo TCA e da via gluconeogénica dos precursores C3. Em ambas as vias, o piruvato entra no ciclo TCA onde é oxidativamente descarboxilado a acetil-CoA via desidrogenase piruvato ou carboxilato a oxaloacetato na reação carboxilase piruvato. Como PC e PDH estão competindo pelo piruvato, eles estão em posições chave para a regulação do metabolismo anaplerótico (ou seja, reabastecimento) e oxidativo, respectivamente. Cohen e colegas de trabalho (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) utilizaram combinações de alanina ou piruvato rotulados e não rotulados, e etanol para investigar a competição do substrato hepático para entrada no ciclo do TCA sob vários estados hormonais e dietéticos de fígados perfundidos de ratos e ratos.
Quando a alanina era o único substrato hepático, C2, C3 e C4 de glutamato e glutamina foram prontamente rotulados como esperado da topologia do ciclo de TCA (Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a). A alanina é transaminada para piruvato, que ou é descarboxilada para acetil-CoA ou carboxilada para oxaloacetato. A acetil-CoA é incorporada ao citrato e, posteriormente, ao α-ketoglutarato, que, por sua vez, pode ser transaminado para glutamato. Por outro lado, o oxaloacetato está em equilíbrio com malato e fumarato (ver secção 5.5.8) e o rótulo é codificado em C2 e C3 de oxaloacetato. A condensação de tais isotopômeros de oxaloacetato com acetil-CoA na reação de sintetização do citrato dá subseqüentemente origem a – e α-ketoglutarate e, portanto, a – e glutamato. A proporção relativa de piruvato que entra no ciclo TCA via PC e PDH pode, portanto, ser estimada pelo enriquecimento relativo do glutamato C2 e C4. Sob a hipótese de um modelo de primeira ordem onde apenas uma volta do ciclo TCA é considerada e a reciclagem contínua da etiqueta é negligenciada (ver Secção 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) calculou rácios de PC versus taxa de fluxo PDH que variavam de 1.2 a 2.6 e 7.7 em fígados de ratazanas doadoras bem alimentadas, diabéticas e com 24 horas de jejum, respectivamente. No fígado diabético, a proporção relativa de piruvato canalizado para o ciclo TCA através das duas vias alternativas não foi alterada pela incubação in vitro com insulina.
Em contraste com experimentos onde a alanina foi o único substrato para o metabolismo hepático, a coadição de etanol não rotulado resultou em glutamato C4 e glutamina C4 essencialmente desprovido de rótulo (Cohen et al., 1979b). O etanol, que é prontamente oxidado pela álcool desidrogenase ao acetaldeído e depois ao acetato, serve como uma fonte adicional para a acetil-CoA. Os resultados indicaram que a acetil-CoA derivada do etanol compete eficientemente com a acetil-CoA que entra no ciclo do TCA via PDH. Assim, na presença de uma fonte alternativa de acetil-CoA, a alanina entrou no ciclo de TCA quase exclusivamente através da reação de PC. Além disso, o co-abastecimento de alanina com etanol aumentou a taxa de consumo de alanina através da reação PC em quase 50% em comparação com fígados perfumados apenas com alanina. Este resultado não é inesperado à luz de uma reação de PC que é regulada pelo nível de acetil-CoA. Uma concentração elevada de acetil-CoA, como estava disponível no metabolismo do etanol, aumentou o fluxo através do PC a fim de ampliar o pool de oxaloacetato para um consumo acelerado de acetil-CoA no ciclo de TCA. Experimentos similares com piruvato rotulado + NH4C1 e etanol como substratos foram realizados e forneceram resultados equivalentes (Cohen, 1987a,b). Além disso, Nedelec et al. (1990b) usaram o modelo proposto por Cohen (1983) para avaliar o efeito da leucemia mieloproliferativa induzida por vírus no metabolismo hepático. O metabolismo da alanina em fígados infectados de doadores em jejum foi semelhante aos controles alimentados. Os fígados de ambos os grupos tiveram uma contribuição reduzida de PC versus PDH para o fluxo de alanina no ciclo de TCA quando comparado com os controles em jejum. A relação alterada do fluxo PC/PDH em fígados em jejum leucêmicos foi explicada pela redução drástica da disponibilidade de triglicerídeos e, portanto, de acetil-CoA nesses órgãos.
13C MRS oferece a possibilidade única de acompanhar o metabolismo do etanol e da alanina simultaneamente (ver Figura 8). Em experimentos onde alanina e etanol foram usados como fontes de carbono, foi produzida acetil-CoA com dois padrões de rotulagem diferentes (Cohen, 1987b). Na entrada da alanina no ciclo de TCA através da reação PDH, a acetil-CoA é formada e a acetil-CoA é derivada do etanol. Além de rotular o citrato, α-ketoglutarato, glutamato e glutamina nas posições C4 e C5, a incorporação da acetil-CoA dá origem a engates spin típicos entre os carbonos vizinhos C4 e C5 de glutamato e glutamina, que são facilmente distinguíveis das ressonâncias singlet geradas pela incorporação de alanina. Assim, uma estimativa direta da competição entre alanina e etanol pode ser obtida a partir da análise da razão singlet-to-multiplet em C4 do glutamato. A análise dos padrões de acoplamento de spin-coupling também foi útil para a atribuição de ressonâncias do glutationa observado em espectros de MR 13C obtidos de fígados perfundidos (Cohen, 1987a). Os padrões de acoplamento de spin-coupling detectados para o glutationa no glutationa na perfusão hepática com precursores marcados com 13C corresponderam intimamente ao padrão de rotulagem observado no glutamato. Assim, concluiu-se que o esqueleto de carbono do glutamato permaneceu intacto e foi diretamente incorporado ao glutatião sintetizado de novo. Mudanças químicas medidas em extratos de PCA de fígados indicaram que o glutationa está presente em sua forma reduzida.
Parte do glutamato, a rotulagem da glutamina hepática foi observada em muitos experimentos. Isto não é surpreendente porque a glutamina é facilmente formada na reação glutamínica sintetase. Cohen et al. (1979b) seguiram o curso temporal da incorporação da etiqueta no glutamato hepático e da glutamina em fígados de camundongos perfundidos na presença de alanina e etanol etiquetado ou não etiquetado. Em todas as condições investigadas, o enriquecimento em glutamato ficou atrás do do glutamato, como evidenciado pela relação C4/C2 das intensidades de sinal 13C MR no glutamato e na glutamina, respectivamente. A razão C4/C2 observada na glutamina em um dado momento não era a mesma que a razão correspondente no glutamato, mas refletia a razão glutamato de cerca de 1 h antes. Esta diferença de tempo foi usada como medida do fluxo através da reação glutamínica sintase controlada alostericamente in vivo. Resultados semelhantes foram obtidos com fígados de ratos perfundidos com acetato (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Entretanto, a interpretação da rotulagem em glutamato e glutamina foi levada um passo adiante. Os autores sugeriram que o glutamato e a glutamina poderiam participar de um ciclo fútil, que compreende as atividades da glutamina sintetizada citosólica, da glutaminase mitocondrial e da troca glutamato/glutamina através das membranas mitocondriais.
Em fígados em jejum perfundidos com alanina e etanol ou piruvato, cloreto de amônio e etanol, aspartato e N-carbamoylaspartato rotulado em C2 e C3 puderam ser observados (Cohen, 1987a). A detecção do aspartato rotulado não é inesperada porque é facilmente formado pela transaminação do oxaloacetato intermediário do ciclo TCA. O N-carbamoylaspartate, entretanto, é produzido no fígado em uma das primeiras etapas da síntese de novo pyrimidine nucleotideo. O N-carbamoylaspartate incorpora a fracção de aspartato intacto, levando assim ao padrão de rotulagem observado. A detecção posterior do rótulo 13C nos produtos finais do percurso, como a uridina e seus produtos de fosforilação, indica que uma síntese líquida de N-carbamoylaspartate, ao contrário do turnover, foi observada em fígados perfurados (Cohen, 1987a).