5.5.9 The Tricarboxylic Acid Cycle
Pyruvate is at the branch point of the catabolic sequence of oxidative glucose metabolism in the TCA cycle and the gluconeogenic pathway from C3 precursors. W obu ścieżkach pirogronian wchodzi do cyklu TCA, gdzie jest albo oksydacyjnie dekarboksylowany do acetylo-CoA przez dehydrogenazę pirogronianową, albo karboksylowany do oksalooctanu w reakcji karboksylazy pirogronianowej. Ponieważ PC i PDH konkurują ze sobą o pirogronian, zajmują one kluczowe pozycje w regulacji odpowiednio metabolizmu anaplerotycznego (tj. uzupełniającego) i oksydacyjnego. Cohen i współpracownicy (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) wykorzystali kombinacje znakowanych i nieznakowanych alaniny lub pirogronianu i etanolu do zbadania konkurencji substratów wątrobowych do wejścia w cykl TCA w różnych hormonalnych i dietetycznych stanach perfuzji wątroby szczurów i myszy.
Gdy alanina była jedynym substratem wątrobowym, C2, C3 i C4 glutaminianu i glutaminy były łatwo znakowane, jak oczekiwano od topologii cyklu TCA (Cohen i in., 1979b; Cohen, 1987a). Alanina jest transaminowana do pirogronianu, który jest albo dekarboksylowany do acetylo-CoA, albo karboksylowany do oksalooctanu. Acetylo-CoA jest włączany do cytrynianu, a następnie do α-ketoglutaranu, który z kolei może być transaminowany do glutaminianu. Z drugiej strony, oksalooctan znajduje się w równowadze z jabłczanem i fumaranem (patrz sekcja 5.5.8), a etykieta jest zakodowana w C2 i C3 oksalooctanu. Kondensacja takich izotopomerów oksalooctanu z acetylo-CoA w reakcji syntazy cytrynianowej prowadzi następnie do powstania – i α-ketoglutaranu, a stąd do – i glutaminianu. Względny udział pirogronianu wchodzącego do cyklu TCA przez PC i PDH można zatem oszacować na podstawie względnego wzbogacenia w glutaminian C2 i C4. Przy założeniu modelu pierwszego rzędu, w którym uwzględnia się tylko jeden obrót cyklu TCA i zaniedbuje się ciągły recykling etykiety (patrz sekcja 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) obliczył stosunek szybkości przepływu PC do PDH, który wahał się od 1,2 do 2,6 i 7,7 odpowiednio w wątrobach szczurów dobrze odżywionych, chorych na cukrzycę i karmionych 24-godzinnymi posiłkami. W wątrobie cukrzycowej, względna proporcja pirogronianu kierowanego do cyklu TCA przez dwie alternatywne ścieżki nie została zmieniona przez inkubację in vitro z insuliną.
W przeciwieństwie do eksperymentów, w których alanina była jedynym substratem metabolizmu wątrobowego, dodanie nieznakowanego etanolu spowodowało powstanie glutaminianu C4 i glutaminy C4 zasadniczo pozbawionych oznakowania (Cohen i in., 1979b). Etanol, który jest łatwo utleniany przez dehydrogenazę alkoholową do aldehydu octowego, a następnie dalej do octanu, służy jako dodatkowe źródło acetylo-CoA. Wyniki badań wskazują, że acetylo-CoA pochodzący z etanolu skutecznie konkuruje z acetylo-CoA wchodzącym do cyklu TCA za pośrednictwem PDH. Tak więc, w obecności alternatywnego źródła acetylo-CoA, alanina wchodziła do cyklu TCA prawie wyłącznie poprzez reakcję PC. Co więcej, współdostarczanie alaniny z etanolem zwiększało tempo zużycia alaniny poprzez reakcję PC o prawie 50% w porównaniu z wątrobami perfundowanymi samą alaniną. Wynik ten nie jest nieoczekiwany w świetle reakcji PC, która jest regulowana przez poziom acetylo-CoA. Podwyższone stężenie acetylo-CoA, jak to było dostępne w metabolizmie etanolu, zwiększyło strumień przez PC w celu powiększenia puli oksalooctanu dla przyspieszonego zużycia acetylo-CoA w cyklu TCA. Przeprowadzono podobne eksperymenty ze znakowanym pirogronianem + NH4C1 i etanolem jako substratami i uzyskano równoważne wyniki (Cohen, 1987a,b). Ponadto, Nedelec i wsp. (1990b) wykorzystali model zaproponowany przez Cohena (1983) do oceny wpływu białaczki mieloproliferacyjnej indukowanej wirusem na metabolizm wątroby. Stwierdzono, że metabolizm alaniny w zakażonych wątrobach poszczących dawców był podobny jak w kontrolach karmionych. W wątrobach obu grup stwierdzono zmniejszony udział PC w stosunku do PDH w metabolizmie alaniny w cyklu TCA, w porównaniu z kontrolami na czczo. Zmieniony stosunek strumienia PC/PDH w białaczkowych wątrobach na czczo został wyjaśniony drastycznie zmniejszoną dostępnością triglicerydów, a tym samym acetylo-CoA w tych narządach.
13C MRS oferuje unikalną możliwość śledzenia metabolizmu etanolu i alaniny jednocześnie (patrz Rysunek 8). W doświadczeniach, w których jako źródła węgla użyto alaniny i etanolu, wytworzono acetylo-CoA o dwóch różnych wzorcach znakowania (Cohen, 1987b). Przy wprowadzaniu alaniny do cyklu TCA poprzez reakcję PDH powstaje acetylo-CoA, a acetylo-CoA pochodzi z etanolu. Oprócz znakowania cytrynianu, α-ketoglutaranu, glutaminianu i glutaminy w pozycjach C4 i C5, przyłączenie acetylo-CoA powoduje powstanie typowych sprzężeń spinowych pomiędzy sąsiednimi węglami C4 i C5 glutaminianu i glutaminy, które są łatwo odróżnialne od rezonansów singletowych generowanych przez przyłączenie alaniny. Stąd, bezpośrednie oszacowanie konkurencji pomiędzy alaniną i etanolem można uzyskać z analizy stosunku singletów do multipletów w C4 glutaminianu. Analiza wzorów sprzężenia spinowego była również przydatna do przypisania rezonansów z glutationu obserwowanych w widmach 13C MR uzyskanych z perfundowanych wątróbek (Cohen, 1987a). Wzorce sprzężenia spinowego wykryte dla cząsteczki glutamylowej w glutationie po perfuzji wątroby prekursorami znakowanymi 13C ściśle odpowiadały wzorcowi znakowania obserwowanemu w glutaminianie. Stwierdzono więc, że szkielet węglowy glutaminianu pozostał nienaruszony i został bezpośrednio włączony do syntetyzowanego de novo glutationu. Przesunięcia chemiczne mierzone w ekstraktach PCA z wątroby wskazały, że glutation jest obecny w swojej zredukowanej formie.
Oprócz glutaminianu, w wielu eksperymentach obserwowano znakowanie wątrobowej glutaminy. Nie jest to zaskakujące, ponieważ glutamina jest łatwo tworzona w reakcji syntazy glutaminy. Cohen i wsp. (1979b) śledzili przebieg czasowy wbudowywania etykiety do wątrobowego glutaminianu i glutaminy w wątrobach myszy perfundowanych w obecności alaniny i znakowanego lub nieznakowanego etanolu. We wszystkich badanych warunkach wzbogacanie glutaminy pozostawało w tyle za wzbogacaniem glutaminianu, o czym świadczy stosunek C4/C2 intensywności sygnału 13C MR odpowiednio w glutaminianie i glutaminie. Stosunek C4/C2 obserwowany w glutaminie w danym czasie nie był taki sam jak odpowiadający mu stosunek w glutaminianie, lecz odzwierciedlał stosunek glutaminianu z około 1 godziny wcześniej. Tę różnicę czasową wykorzystano jako miarę strumienia przepływającego przez allosterycznie kontrolowaną reakcję syntazy glutaminy in vivo. Podobne wyniki uzyskano w wątrobach szczurów perfundowanych octanem (Desmoulin i in., 1985; Canioni i in., 1985). Interpretacja oznaczeń glutaminianu i glutaminy została jednak posunięta o krok dalej. Autorzy zasugerowali, że glutaminian i glutamina mogą brać udział w daremnym cyklu, na który składają się aktywności cytozolowej syntazy glutaminy, mitochondrialnej glutaminazy i wymiany glutaminian/glutamina przez błony mitochondrialne.
W poszczonych wątrobach perfundowanych alaniną i etanolem lub pirogronianem, chlorkiem amonu i etanolem, można było zaobserwować asparaginian i N-karbamoilasparaginian znakowane w C2 i C3 (Cohen, 1987a). Wykrycie znakowanego asparaginianu nie jest nieoczekiwane, ponieważ jest on łatwo tworzony przez transaminację pośredniego produktu cyklu TCA – oksalooctanu. N-karbamoilasparaginian jest jednak wytwarzany w wątrobie w jednym z pierwszych etapów syntezy de novo nukleotydów pirymidynowych. N-karbamoilasparaginian zawiera nienaruszoną cząsteczkę asparaginianu, co prowadzi do obserwowanego wzoru znakowania. Dalsze wykrywanie etykiety 13C w produktach końcowych szlaku, takich jak urydyna i jej produkty fosforylacji, wskazuje, że synteza netto N-karbamoilasparaginianu, w przeciwieństwie do obrotu, została zaobserwowana w perfundowanej wątrobie (Cohen, 1987a).
.