Adskillelse af protein-kodende og ikke-kodende gener i det menneskelige genom

Men derimod viser de forældreløse børn et helt andet billede. De er i det væsentlige ikke til at skelne fra matchede tilfældige kontroller (Fig. 2 b) og ligner ikke engang den hurtigst udviklende delmængde af de 18.572 gener med modstykker på tværs af arterne. Kort sagt viser sættet af forældreløse ingen som helst tendens til at bevare læserammen.

Codon-substitutionsfrekvens.

CSF-scoren giver en supplerende test af for det evolutionære mønster for protein-kodende gener. Mens RFC-scoren er baseret på indels, er CSF-scoren baseret på de forskellige mønstre for nukleotid-substitution, der ses i protein-kodende DNA i forhold til tilfældigt DNA. Denne metode, der for nylig blev udviklet til sammenlignende genomisk analyse af Drosophila-arter (11), beregner en CSF-score (codon substitution frequency) på grundlag af alignments på tværs af mange arter. Vi anvendte CSF-metoden på tilpasninger af mennesket til ni pattedyrarter, bestående af højdækkende sekvenser (≈7×) fra mus, hund, rotte, ko og opossum og lavdækkende sekvenser (≈2×) fra kanin, bæltedyr, elefant og tenrec.

Resultaterne viste igen en stærk differentiering mellem gener med modstykker på tværs af arter og forældreløse gener. Blandt 16.210 gener med simpel ortologi gav 99,2 % CSF-scoringer, der var i overensstemmelse med den forventede evolution af proteinkodende gener. Derimod omfatter de 1.177 forældreløse kun to tilfælde, hvis kodon-evolutionsmønster indikerede et gyldigt gen. Ved inspektion var disse to tilfælde klare fejl i annotationen af det menneskelige gen; ved at oversætte sekvensen i en anden ramme kan der identificeres en klar ortolog på tværs af arter.

Orphans Do Not Represent Protein-Coding Genes.

Overstående resultater er i overensstemmelse med, at orphans blot er tilfældige ORF’er, snarere end gyldige menneskelige protein-kodende gener. Overensstemmelse er dog ikke ensbetydende med bevis. Vi må snarere strengt forkaste den alternative hypotese.

Sæt, at de forældreløse repræsenterer gyldige menneskelige protein-kodende gener, som mangler tilsvarende ORF’er i mus og hund. De forældreløse ville falde i to klasser: (i) nogle kan være fra før divergensen fra mus og hund – dvs. de er forfædres gener, der er gået tabt i både mus og hund, og (ii) nogle kan være fra efter divergensen – dvs. de er nye gener, der er opstået i den slægt, der fører til mennesket. Hvordan kan vi udelukke disse muligheder? Vores løsning var at studere to primate slægtninge: makaken og chimpansen. Vi overvejer alternativerne efter tur.

1. Sæt, at de forældreløse er forfædres pattedyrgener, som gik tabt i hund og mus, men som er bevaret i den slægt, der fører til mennesket. I så fald ville de stadig være til stede og funktionelle i makak og chimpanse, undtagen i det usandsynlige tilfælde, at de også undergik uafhængige tabsbegivenheder i både makak- og chimpansens slægter.

2. Sæt, at de forældreløse er nye gener, der opstod i den slægt, der fører til mennesket, efter divergensen fra hund og mus . Hvis man antager, at genereringen af nye gener er en konstant proces, bør fødselsdatoerne være fordelt over denne periode. I så fald vil de fleste af fødselsdatoerne ligge før divergensen fra makaken (≈30 Mya) og næsten alle vil ligge før divergensen fra chimpansen (≈6 Mya) (12).

I henhold til et af de to ovenstående scenarier må langt størstedelen af de forældreløse børn svare til funktionelle protein-kodende gener i makaken eller chimpansen.

Vi testede derfor ved hjælp af RFC-score, om de forældreløse viser tegn på bevarelse af proteinkodning i forhold til enten makak eller chimpansee. Det er påfaldende, at fordelingen af RFC-scorerne for de forældreløse børn stort set er identisk med fordelingen for de tilfældige kontroller (fig. 2 d og f). Fordelingen for de forældreløse ligner ikke den, der ses selv for den øverste 1% af de mest hurtigt udviklende gener med modstykker på tværs af arter (SI Fig. 7-9).

Sættet af forældreløse gener viser således ikke noget som helst bevis for bevarelse af læserammer, selv ikke hos vores nærmeste primat-slægtninge. (Det er naturligvis muligt, at de forældreløse omfatter nogle få gyldige protein-kodende gener, men andelen må være så lille, at den ikke har nogen mærkbar effekt på den samlede RFC-fordeling). Vi konkluderer, at langt størstedelen af de forældreløse ikke svarer til funktionelle protein-kodende gener i makak og chimpanse, og at de således hverken er forfædres eller nyopståede gener.

Hvis de forældreløse repræsenterer gyldige menneskelige proteinkodende gener, må vi konkludere, at langt størstedelen af de forældreløse gener blev født efter afvigelsen fra chimpansee. En sådan model ville kræve en fantastisk genfødselsrate i pattedyrslinjerne og en voldsom gen-dødshastighed, der udraderer det enorme antal gener, der er født før divergensen fra chimpansen. Vi afviser en sådan model som fuldstændig usandsynlig. Vi konkluderer derfor, at langt størstedelen af de forældreløse er simpelthen tilfældigt forekommende ORF’er, der ikke repræsenterer proteinkodende gener.

Sluttelig bemærker vi, at den omhyggelige filtrering af det menneskelige genkatalog ovenfor var afgørende for analysen ovenfor, fordi den eliminerede pseudogener og artefakter, der ville have forhindret en præcis analyse af de forældreløse geners egenskaber.

Eksperimentelt bevis for kodede proteiner.

Som en uafhængig kontrol af vores konklusion gennemgik vi den videnskabelige litteratur for offentliggjorte artikler, der omtaler de forældreløse for at afgøre, om der var eksperimentelt bevis for kodede proteiner. Mens langt størstedelen af de velundersøgte gener er blevet direkte vist at kode for et protein, fandt vi artikler, der rapporterede eksperimentelt bevis for et kodet protein in vivo for kun 12 ud af 1 177 forældreløse, og nogle af disse rapporter er tvetydige (SI tabel 2). De eksperimentelle beviser er således i overensstemmelse med vores konklusion, at langt de fleste ikke-konserverede ORF’er ikke er proteinkodende. I den håndfuld tilfælde, hvor der findes eller findes eksperimentelle beviser i fremtiden, kan generne genoptages i kataloget fra sag til sag.

Revision af de menneskelige genkataloger.

Med stærke beviser for, at langt størstedelen af de forældreløse gener ikke er protein-kodende gener, er det muligt at revidere de menneskelige genkataloger på en principiel måde.

Ensembl-katalog.

Vores analyser af Ensembl-kataloget (v35) viser, at det indeholder 19.108 gyldige protein-kodende gener på kromosomerne 1-22 og X inden for den nuværende genomsamling. De resterende 15 % af posterne er elimineret som retroposoner, artefakter eller forældreløse. Sammen med det mitochrondriale kromosom og kromosom Y , når det samlede antal op på 19 199.

Vi udvidede analysen til Ensembl (v38)-kataloget, hvor 2 212 formodede gener blev tilføjet, og mange tidligere poster blev revideret eller slettet. Vores beregningsmæssige pipeline fandt 598 yderligere gyldige proteinkodningsgener baseret på modstykker på tværs af arter, 1.135 retroposoner og 479 forældreløse gener. RFC-kurverne for de forældreløse svarede igen nøje til forventningen for tilfældigt DNA.

Andre kataloger.

Vi anvendte samme fremgangsmåde på Vega (v34) og RefSeq (marts 2007)-kataloget. Begge kataloger indeholder en betydelig andel af poster, der tilsyneladende ikke er gyldige proteinkodende gener (henholdsvis 16 % og 10 %), baseret på manglen på et modstykke på tværs af arter (se SI Fig. 10 og SI Appendix ). Hvis vi begrænser RefSeq-posterne til dem med den højeste tillid (med det forbehold, at dette sæt indeholder langt færre gener), synes kun 1 % at være ugyldige. Tilsammen tilføjer disse to kataloger yderligere 673 protein-kodende gener.

Kombineret analyse.

Kombinerer vi analysen af de tre store genkataloger, finder vi, at kun 20 470 af de 24 551 poster ser ud til at være gyldige protein-kodende gener.

Begrænsninger i analysen.

Vores analyse af de nuværende genkataloger har visse begrænsninger, som bør bemærkes.

For det første har vi elimineret alle pseudogener og forældreløse gener. Vi fandt seks rapporterede tilfælde, hvor et behandlet pseudogen eller transposon gennemgik en exaptation for at producere et funktionelt gen (SI tabellerne 1 og 3), og 12 rapporterede tilfælde af forældreløse med eksperimentelt bevis for et kodet protein. Disse 18 tilfælde kan let genindføres i kataloget (hvilket øger antallet til 20.488). Der er yderligere tilfælde af potentielt funktionelle retroposoner, som ikke findes i de nuværende genkataloger (15). Hvis nogen af dem viser sig at producere protein, bør de også medtages.

For det andet har vi ikke taget hensyn til de 197 formodede gener, der ligger i de “ukortlagte contigs”. Disse regioner er sekvenser, der blev udeladt fra den færdige samling af det menneskelige genom. De består i vid udstrækning af segmentale duplikationer, og de fleste af generne ligner i høj grad andre gener i samlingen. Mange af disse sekvenser kan repræsentere alternative alleler eller fejlsamlinger af genomet. Imidlertid er regioner med segmental duplikation kendt for at være børnehaver for evolutionær innovation (16) og kan indeholde nogle gyldige gener. De fortjener fokuseret opmærksomhed.

For det tredje og vigtigst af alt blev de ikke-konserverede ORF’er, der er undersøgt her, typisk medtaget i de nuværende genkataloger, fordi de har potentiale til at kode for mindst 100 aminosyrer. Vi ved derfor ikke, om vores konklusioner ville gælde for meget kortere ORF’er. I princippet findes der mange yderligere proteinkodende gener, der koder for korte proteiner, f.eks. peptidhormoner, som normalt oversættes fra meget større forløbere og kan udvikle sig hurtigt. Det burde være muligt at undersøge egenskaberne ved mindre ORF’er ved at bruge yderligere pattedyrarter ud over mus og hund.

Improving Gene Annotations.

I løbet af vores arbejde genererede vi detaljerede grafiske “rapportkort” for hver af de 22.218 formodede gener i Ensembl (v35). Rapportkortene viser genets struktur, sekvenstilpasninger, mål for evolutionær bevarelse og vores endelige klassifikation (fig. 3).