Mary blev født på Linlithgow Palace i West Lothian den 8. december 1542 og blev dronning af Skotland, da hun var seks dage gammel.
Hendes krav på den engelske trone var næsten lige så stærke som hendes krav på den skotske trone. Som Henry VII af Englands oldebarn var Mary den næste i rækken til den engelske trone efter Henry VIII’s børn.
I betragtning af hendes ungdom og køn besluttede den skotske adel, at de måtte slutte fred med England, og de blev enige om, at hun skulle gifte sig med Henrik VIII’s søn, den kommende Edward VI.
Snart var traktaten imidlertid ikke blevet arrangeret, før katolikker, der var imod planen, tog den unge Mary med til Stirling Castle, og til Henrys vrede brød de ægteskabet, idet de foretrak at vende tilbage til Skotlands traditionelle alliance med Frankrig.
Henrik beordrede herefter den brutale række af togter ind i Skotland, der er kendt som “The Rough Wooing”. Hans hær satte ild til klosteret Holyroodhouse, hvor Jakob V. var begravet, brændte afgrøder i Tweed-dalen og satte ild til grænseklostrene Melrose, Jedburgh og Dryburgh.
Undslået forlovede skotterne i 1548 Mary med den franske kong Henri II’s arving, Dauphin Francis, og sendte hende til at blive opdraget ved det franske hof. Det siges, at stavemåden af det kongelige familienavn Stewart blev ændret til Stuart på det tidspunkt for at passe til den franske konventionelle stavemåde.
Lang, yndefuld og kvik giftede Mary sig med Dauphin i Paris den 24. april 1558. Han overtog sin fars trone i 1559, hvilket gjorde Mary til dronning af Frankrig såvel som af Skotland, men hans regeringstid var kort, for han døde af en øreinfektion i 1560.
Året efter besluttede Mary, på trods af sine venners advarsler, at tage tilbage til Skotland, som nu var et officielt protestantisk land efter religiøse reformer under ledelse af John Knox.
Hun var romersk-katolik, men hendes halvbror, lord James Stewart, senere jarl af Moray, havde forsikret hende om, at hun ville få lov til at dyrke sin religion, som hun ønskede, og i august 1561 vendte hun tilbage til en uventet varm velkomst fra sine protestantiske undersåtter.
I begyndelsen regerede Mary med succes og med mådehold, rådgivet af lord James og William Maitland of Lethington, en snu diplomat. Hendes ægteskab i 1565 med sin anden fætter Henry, Lord Darnley (tipoldebarn af Henry VII) indledte imidlertid en tragisk række af begivenheder, som blev forværret af facetterede skotske adelsmænd.
Darnley, der var opbragt og småfornærmet, blev et redskab for Marys fjender og brød sammen med en gruppe sammensvorne ind i hendes spisesal, truede den højgravide dronning og myrdede hendes sekretær, David Riccio, den 9. marts 1566 inde i Palace of Holyroodhouse.
Førslen af Mary og Darnleys søn James samme sommer forbedrede ikke deres forhold, og da Darnley blev myrdet i Kirk o’Field, lige uden for Edinburghs mure den 10. februar 1567, mistænkte folk, at hun var indblandet i forbrydelsen.
Hendes efterfølgende ægteskab tre måneder senere med jarlen af Bothwell (som almindeligvis menes at være hovedmorderen) bragte hende uundgåeligt i ruin. Hendes protestantiske herrer rejste sig mod hende, og hendes hær konfronterede deres ved Carberry Hill, nær Edinburgh, den 15. juni 1567.
Hun overgav sig, blev fængslet på Lochleven Castle i Kinross-shire og blev tvunget til at abdicere til fordel for sin spæde søn. Bothwell flygtede til Skandinavien, hvor han blev arresteret og holdt fanget indtil sin død.
Mary flygtede fra Lochleven i 1568, men blev dog besejret i slaget ved Langside, nær Glasgow, den 13. maj. Hun flygtede sydpå og søgte tilflugt i England i den tro, at dronning Elizabeth I ville støtte hendes sag, men i stedet blev hun holdt i fangenskab i England i 19 år.
Fokus for en lang række romersk-katolske komplotter mod Elizabeth, der kulminerede i Babington-komplottet om at myrde den engelske dronning, førte til, at Elizabeths ministre krævede Marys henrettelse: “så længe der er liv i hende, er der håb; så længe de lever i håb, lever vi i frygt”.
Mary blev endelig henrettet på Fotheringhay Castle i Northamptonshire den 8. februar 1587 i en alder af 44 år.
Hun blev begravet i Peterborough Cathedral, men i 1612 fik hendes søn James VI og I hendes lig opgravet og anbragt i hvælvingen i kong Henrik VII’s kapel i Westminster Abbey.