Syntyi Linlithgow’n palatsissa Länsi-Lothianissa 8. joulukuuta 1542, ja hänestä tuli Skotlannin kuningatar kuuden päivän ikäisenä.
Hänen vaatimuksensa Englannin valtaistuimelle olivat lähes yhtä vahvat kuin hänen vaatimuksensa Skotlannin valtaistuimelle. Englannin Henrik VII:n lapsenlapsenlapsena Maria oli seuraava Englannin valtaistuimelle Henrik VIII:n lasten jälkeen.
Maarian nuoruuden ja sukupuolen vuoksi Skotlannin aatelisto päätti, että heidän oli solmittava rauha Englannin kanssa, ja he sopivat, että Mary nai Henrik VIII:n pojan, tulevan Edward VI:n.
Vaikka sopimus oli kuitenkin sovittu, kun suunnitelmaa vastustavat katolilaiset veivät nuoren Marian Stirlingin linnaan ja Henrikin raivoksi rikkoivat avioliiton mieluummin palaamalla Skotlannin perinteiseen liittoon Ranskan kanssa.
Henrikin määräsi tämän jälkeen Skotlantiin raakalaismaisen ryöstöretkien sarjan, joka tunnetaan nimellä ”Karkea kosinta”. Hänen armeijansa sytytti tuleen Holyroodhousen luostarin, jonne Jaakko V. oli haudattu, poltti viljelmiä Tweedin laaksossa ja sytytti tuleen Melrosen, Jedburghin ja Dryburghin raja-alueen luostarit.
Lannistumatta skotit kihloivat Marian vuonna 1548 Ranskan kuninkaan Henrik II:n perilliselle, dauphin Fransiskukselle, ja lähettivät hänet kasvatettavaksi Ranskan hoviin. Sanotaan, että kuninkaallisen sukunimen Stewartin kirjoitusasu muuttui tuolloin Stuartiksi, jotta se sopisi ranskalaiseen tavanomaiseen kirjoitusasuun.
Pitkä, siro ja nopeaälyinen Maria avioitui Dauphinin kanssa Pariisissa 24. huhtikuuta 1558. Hän nousi isänsä valtaistuimelle vuonna 1559, mikä teki Mariasta sekä Ranskan että Skotlannin kuningattaren, mutta hänen valtakautensa jäi lyhyeksi, sillä hän kuoli korvatulehdukseen vuonna 1560.
Seuraavana vuonna Maria päätti ystäviensä varoituksista huolimatta palata Skotlantiin, joka oli nyt virallisesti protestanttinen maa John Knoxin johtamien uskonnollisten uudistusten jälkeen.
Maria oli roomalaiskatolinen, mutta hänen velipuolensa, lordi James Stewart, myöhempi Morayn jaarli, oli vakuuttanut hänelle, että hän saisi harjoittaa uskontoa haluamallaan tavalla, ja elokuussa 1561 hän palasi ja sai odottamattoman lämpimän vastaanoton protestanttisilta alamaisiltaan.
Maria hallitsi aluksi menestyksekkäästi ja maltillisesti lordi Jamesin ja hienovaraisten diplomaattien William Maitland of Lethingtonin neuvosta. Hänen vuonna 1565 solmimansa avioliitto pikkuserkkunsa Henryn, lordi Darnleyn (Henrik VII:n lapsenlapsenlapsenlapsen) kanssa käynnisti kuitenkin traagisen tapahtumasarjan, jota pahensivat eripuraiset skotlantilaiset aateliset.
Halvaantuneesta ja kärttyisästä Darnleystä tuli Marian vihollisten työkalu, ja joukko salaliittolaisia tunkeutui hänen illalliskammioonsa, uhkaili raskaasti raskaana olevaa kuningatarta ja murhasi hänen sihteerinsä David Riccion 9. maaliskuuta 1566 Holyroodhousen palatsissa.
Marian ja Darnleyn pojan Jamesin syntymä samana kesänä ei mitenkään parantanut heidän suhdettaan, ja kun Darnley murhattiin Kirk o’Fieldissä Edinburghin muurien ulkopuolella 10. helmikuuta 1567, ihmiset epäilivät, että Mary oli osallisena rikoksessa.
Hänen kolme kuukautta myöhemmin solmimansa avioliitto Bothwellin jaarlin kanssa (jota yleisesti pidetään pääasiallisena murhaajana) toi Marylle väistämättömän turman. Hänen protestanttiset lordinsa nousivat häntä vastaan, ja hänen armeijansa kohtasi heidän armeijansa Carberry Hillissä lähellä Edinburghia 15. kesäkuuta 1567.
Hän antautui, joutui vankilaan Lochlevenin linnaan Kinross-shireen ja joutui luopumaan vallasta pienen poikansa hyväksi. Bothwell pakeni Skandinaviaan, jossa hänet pidätettiin ja pidettiin vankina kuolemaansa saakka.
Mary pakeni Lochlevenistä vuonna 1568, mutta kärsi tappion Langsiden taistelussa Glasgow’n lähellä 13. toukokuuta. Hän pakeni etelään ja etsi suojaa Englannista uskoen, että kuningatar Elisabet I tukisi hänen asiaansa, mutta sen sijaan häntä pidettiin vankina Englannissa 19 vuotta.
Elisabetia vastaan suunnattujen pitkien roomalaiskatolisten salaliittojen keskipisteenä, joka huipentui Babingtonin salaliittoon Englannin kuningattaren salamurhasta, Elisabetin ministerit vaativat Marian teloitusta: ”niin kauan kuin hänessä on elämää, on toivoa; niin kauan kuin he elävät toivossa, me elämme pelossa”.
Maria teloitettiin lopulta Fotheringhayn linnassa Northamptonshiressä 8. helmikuuta 1587, 44-vuotiaana.
Hänet haudattiin Peterborough’n katedraaliin, mutta vuonna 1612 hänen poikansa Jaakko VI ja I saivat haudata hänen ruumiinsa ja sijoittaa sen Westminster Abbeyn kuningas Henrik VII:n kappelin holviin.