Restriction-modification
Restriction-modification-systemer (RM) findes overalt i det prokaryote rige, hvor de fungerer som forsvarssystemer mod fremmed DNA. I øjeblikket kendes 47 type I-systemer, 3320 type II-systemer og otte type III-systemer. R. Roberts (Beverly, MA) påpegede, at restriktionsenzymer indtil for nylig er blevet identificeret ved at udtage bakterier fra kultursamlinger og miljøprøver og analysere dem for restriktionsaktivitet. Nu er det muligt at screene nye DNA-sekvenser for DNA-methyltransferase (MTase)-gener, som kan identificeres ved hjælp af deres bevarede motiver, og derefter lede efter associerede gener. Disse er gode kandidater for restriktionsendonuklease-gener, fordi DNA-methyltransferase- og restriktionsendonuklease-generne ofte er forbundet. Nylige genomprojekter har identificeret et uventet stort antal formodede RM-systemer på denne måde. Der blev f.eks. identificeret 25 forskellige MTase-gener i Helicobacter pylori-genomet, og nogle af disse var forbundet med restriktionsenzymgener. Screening af databaser kan derfor blive en meget produktiv metode til at finde restriktionsenzymer med nye specificiteter. A. Piekarowicz (Warszawa, Polen) rapporterede om et eksempel på en sådan fremgangsmåde, der førte til identifikation af et nyt type IC-restriktionsenzym, NgoAXVI.
Type I- og type III-restriktionsenzymer samt det methyl-afhængige McrBC-enzym kræver to genkendelsessteder og er afhængige af ATP-hydrolyse (McrBC: GTP) for DNA-spaltning (gennemgået i Rao et al., 2000). Spaltning sker, når to sådanne enzymer støder sammen under translokation af DNA, hvilket forklarer kravet om to steder (Figur (Figur2).2). T. Bickle (Basel, Schweiz) viste, at type I-enzymer og McrBC også kan stimuleres til at kløve DNA, når de løber ind i en uspecifik blokering. Type III-enzymer hæmmes derimod af sådanne blokeringer, fordi hvert translokationsenzym kun klipper én streng og kræver samarbejde med et andet enzym for at klippe begge DNA-strenge.
Figur 2. Model for aktivering af restriktionsenzymer, der kræver ATP (eller GTP) til DNA-spaltning. Efter binding af to enzymmolekyler (eller -komplekser) til to genkendelsessteder på et lineært DNA-molekyle translokation af DNA’et i en aktiv, energiafhængig proces, som kræver ATP eller GTP, afhængigt af systemet. Derved bliver DNA’et sløjfet. Spaltningen sker efter kollision af to translokationskomplekser, på tilfældige steder i nærheden af genkendelsesstederne (type III-enzymer og McrBC) eller længere væk fra dem (type I-enzymer).
Og selv om de fleste type II-restriktionsenzymer er homodimere, der interagerer med én kopi af deres palindromiske genkendelsessted, findes der undertyper, der kræver samarbejde mellem to steder (gennemgået i Pingoud og Jeltsch, 1997). Som påpeget af S. Halford (Bristol, UK) er dette ikke kun tilfældet for type IIe-enzymer, som NaeI, men også for type IIf-enzymer, som SfiI, og type IIS-enzymer, som FokI. Type IIf-enzymerer er homotetramere med to separate DNA-bindingssteder, som hver er dannet af to underenheder. SfiI er kun aktiv, når begge DNA-bindingssteder er besat, hvilket fører til en samtidig spaltning af begge steder. For FokI, som består af et spaltnings- og et genkendelsesdomæne, er det tidligere blevet vist, at dimerisering af enzymet på DNA’et er nødvendig for, at spaltning kan finde sted. Halford har nu vist, at to genkendelsessteder er nødvendige for effektiv spaltning, fordi hvert af genkendelsesdomænerne skal interagere med en genkendelsessekvens. Alle tre typer enzymer virker optimalt med to steder på det samme DNA, hvor de fanger DNA’et mellem stederne i en løkke.
Atypiske type II-restriktionsenzymer bliver fortsat opdaget. BbvCI er et heterodimært restriktionsenzym, der genkender en asymmetrisk sekvens. Underenhederne er inaktive hver for sig, men aktive sammen. Dette gør det muligt at fremstille specifikke knækningsenzymer ved at inaktivere den ene underenhed ved hjælp af stedbestemt mutagenese, som det blev rapporteret af G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Litauen) opnåede et lignende resultat for det heterodimere restriktionsenzym Bpu10I. Det lykkedes ham også at lempe substratspecificiteten for Eco57I, et monomerisk restriktions- og modificeringsenzym, som har et enkelt målgenkendelsesdomæne. I denne undersøgelse blev der anvendt tilfældig mutagenese til at generere en variant, der ikke kun interagerer med det kanoniske CTGAAG-sted, men også med CTGGAG-steder. Det molekylære grundlag for denne afslappede specificitet er endnu ikke blevet fastlagt. V. Siksnys (Vilnius, Litauen) rapporterede om opdagelsen af et nyt type IIs restriktionsenzym, BfiI, som ikke er afhængig af tosidige metalioner til spaltning. Dette enzym viser sekvensmæssig lighed med en uspecifik nuclease fra Salmonella typhimurium og anvender formodentlig en lignende katalytisk mekanisme.
A. Pingoud (Giessen, Tyskland) diskuterede mekanismen for DNA-spaltning af type II restriktionsenzymer og homing endonukleaser, som har en fælles funktion, men som generelt har forskellige strukturer og formodentlig følger forskellige spaltningsmekanismer. På trods af at der foreligger detaljerede strukturoplysninger for mange restriktionsenzymer, der har et fælles katalytisk motiv, er der ingen konsensus om den katalytiske mekanisme eller antallet af Mg2+-ioner, der er involveret i katalysen. I princippet gælder det samme for andre fosforyltransferaser med et restriktionsenzymlignende katalytisk center. Som eksempler på sådanne proteiner kan nævnes Vsr-reparationsenzym (E. coli) og Hjc-resolvase (Pyrococcus furiosus). Krystalstrukturen af sidstnævnte blev præsenteret af K. Morikawa (Osaka, Japan) (Figur (Figur3).3). I modsætning hertil synes mekanismen for DNA-spaltning ved de homing endonukleaser af HNH-familien, f.eks. I-PpoI, at være bedre fastlagt, fordi der foreligger strukturelle oplysninger for det frie enzym såvel som for enzym-substrat- og enzym-produktkomplekser, foruden detaljerede biokemiske oplysninger for dette og beslægtede enzymer af “ββα-Me finger”-superfamilien. Disse enzymer kræver en Mg2+-ion som cofaktor, der er bundet til en konserveret Asn. Den angribende hydroxyl-ion genereres af en konserveret His, stabilisering af overgangstilstanden involverer en konserveret Arg, og protonering af afgangsgruppen opnås ved hjælp af et vandmolekyle fra Mg2+-ionens hydreringssfære.
Fig. 3. Sammenligning af restriktionsendonukleasefolderne af Hjc og Vsr som et eksempel på bevarelse af strukturer for enzymer med beslægtede funktioner. Bånddiagrammerne for Hjc og Vsr er vist i samme orientering efter overlejring af de to strukturer. Sidekæderne til resterne på det aktive sted er fremhævet, og de to bevarede Asp-rester er markeret. Denne figur blev venligst stillet til rådighed af T. Nishino og K. Morikawa.
Bakterier har udviklet RM-systemer til at bekæmpe bakteriofager. Disse har til gengæld udviklet forskellige midler til at undslippe restriktionerne fra bakterielle RM-systemer. D. Dryden (Edinburgh, UK) rapporterede resultaterne af en biokemisk analyse af genet 0.3-protein fra bakteriofagen T7, som er en inhibitor af type I restriktionsmodifikationsenzymer. Dette protein binder sig stoikiometrisk til restriktionsenzymet og udfylder formentlig på grund af sin aflange form og negative overfladeladning enzymets DNA-bindingssted fuldstændigt og forhindrer derved DNA-binding.
RM-systemer består af restriktionsendonukleaser og DNA-methyltransferaser (MTaser) (gennemgået i Cheng, 1995; Robertson og Wolffe, 2000). Da DNA-methyleringsmønsteret imidlertid tilføjer information til DNA’et og derved udvider dets kodningskapacitet, er MTaser ikke kun ledsagere af restriktionsenzymer i RM-systemer, men har mange andre vitale funktioner. I prokaryoter spiller de en rolle i DNA-reparation og i reguleringen af genekspression og DNA-replikation. I eukaryoter fører DNA-methylering generelt til transkriptionel stilhed af gener. Den bidrager til epigenetiske processer som f.eks. inaktivering af X-kromosomer, prægning og genregulering. Med opdagelsen af, at flere DNA MTaser er afgørende for udviklingen hos mus, er betydningen af DNA-methylering blevet bredt accepteret.
X. Cheng (Atlanta, GA) præsenterede strukturen af Dnmt2-proteinet, som kunne være den første struktur af en eukaryotisk DNA MTase. Proteinet har en MTasefold og besidder alle de karakteristiske katalytiske motiver, men synes at være blottet for enhver katalytisk aktivitet. Dette rejser spørgsmål om, hvorvidt det rent faktisk er et enzym, og hvad dets substrat egentlig er (DNA, RNA eller noget andet). Yderligere diskussioner om eukaryote enzymer af Cheng og A. Jeltsch (Giessen, Tyskland) drejede sig om enzymerne Dnmt1, Dnmt3a og Dnmt3b. Begge talere rapporterede om resultater, der er opnået med afkortede proteiner og isolerede domæner af disse enorme enzymer (med op til 1700 aminosyrerester), og de fremlagde også resultater vedrørende enzymatisk analyse af rensede enzymer. Da det katalytiske domæne af Dnmt1 (∼500 aminosyrerester) ikke er aktivt i isoleret form, må det være under nøje kontrol af andre dele af enzymet. Denne interaktion kan være nødvendig for at sikre en høj specificitet for hemimetyleret DNA. På trods af fremskridtene på området er DNA-methyleringsprocessen hos eukaryoter, navnlig de mekanismer, der skaber DNA-methyleringsmønstret, stadig dårligt forstået.
Der vides noget mere om DNA-methylering hos prokaryoter. R. Gumport (Urbana, IL) præsenterede strukturen af den prokaryote M.RsrI MTase, hvilket bekræfter formodningen om, at de katalytiske domæner i alle MTaser har en fælles arkitektur. S. Klimasauskas (Vilnius, Litauen), D.N. Rao (Bangalore, Indien), Gumport og Jeltsch drøftede den molekylære enzymologi for fire prokaryote MTaser (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI og M.EcoRV). Den katalytiske cyklus for disse enzymer omfatter DNA- og kofaktorbinding, placering og genkendelse af målsted og konformationsændringer af komplekset, herunder baseflipping og overførsel af methylgrupper (figur (figur4).4). Forskelle i detaljer blev tydelige; f.eks. er rækkefølgen af substrat- og cofaktorbinding og det hastighedsbegrænsende trin forskellig i de forskellige MTaser. 2-aminopurin viste sig at være et godt værktøj til analyse af kinetikken af de konformationsændringer, som DNA’et gennemgår i kompleks med MTaser, herunder baseflipping.
Figur 4. Mekanisme for placering af målsted ved restriktionsendonukleaser og DNA-methyltransferaser. Først bindes DNA uspecifikt, derefter lokaliseres målstedet ved faciliteret diffusion (glidning og hopping) på DNA’et. Kontakter med målpladserne fremkalder konformationsændringer af enzymet og DNA’et, som igen udløser katalysen. Denne mekanisme er fælles for de fleste enzymer, der interagerer specifikt med DNA.