5.5.9 Tricarboxylsyrecyklus
Pyruvat befinder sig ved forgreningen af den kataboliske sekvens af oxidativ glukosemetabolisme i TCA-cyklus og den glukoneogene vej fra C3-prækursorer. I begge veje kommer pyruvat ind i TCA-cyklus, hvor det enten oxidativt decarboxyleres til acetyl-CoA via pyruvatdehydrogenase eller carboxyleres til oxaloacetat i pyruvatcarboxylasereaktionen. Da PC og PDH konkurrerer om pyruvat, indtager de nøglepositioner for reguleringen af henholdsvis den anaplerotiske (dvs. genopfyldning) og oxidative metabolisme. Cohen og medarbejdere (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) anvendte kombinationer af mærket og umærket alanin eller pyruvat og ethanol til at undersøge hepatisk substratkonkurrence for indgang i TCA-cyklus under forskellige hormonelle og diætmæssige tilstande i perfunderede rotte- og muselever.
Når alanin var det eneste hepatiske substrat, blev C2, C3 og C4 af glutamat og glutamin let mærket som forventet ud fra topologien af TCA-cyklusen (Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a). Alanin transamineres til pyruvat, som enten decarboxyleres til acetyl-CoA eller carboxyleres til oxaloacetat. Acetyl-CoA inkorporeres i citrat og efterfølgende i α-ketoglutarat, som igen kan transamineres til glutamat. På den anden side er oxaloacetat i ligevægt med malat og fumarat (se afsnit 5.5.8), og mærkatet er scrambled ind i C2 og C3 af oxaloacetat. Kondensation af sådanne oxaloacetat-isotopomerer med acetyl-CoA i citratsyntasereaktionen giver efterfølgende anledning til – og α-ketoglutarat og dermed til – og glutamat. Den relative andel af pyruvat, der går ind i TCA-cyklusen via PC og PDH, kan derfor vurderes ud fra den relative berigelse i glutamat C2 og C4. Under antagelse af en model af første orden, hvor der kun tages hensyn til én tur i TCA-cyklusen, og hvor der ses bort fra kontinuerlig genanvendelse af mærket (se afsnit 5.3.7), beregnede Cohen (1983, 1987c) forhold mellem PC- og PDH-flowhastigheden, der varierede fra 1,2 til 2,6 og 7,7 i lever fra henholdsvis velernærede, diabetiske og 24-timers-fattige donorrotter. I diabetisk lever blev den relative andel af pyruvat, der blev kanaliseret ind i TCA-cyklusen gennem de to alternative veje, ikke ændret ved in vitro inkubation med insulin.
I modsætning til eksperimenter, hvor alanin var det eneste substrat for hepatisk metabolisme, resulterede samtilsætning af umærket ethanol i glutamat C4 og glutamin C4, der stort set var blottet for mærkning (Cohen et al., 1979b). Ethanol, som let oxideres af alkoholdehydrogenase til acetaldehyd og derefter videre til acetat, tjener som en yderligere kilde til acetyl-CoA. Resultaterne viste, at acetyl-CoA afledt af ethanol effektivt konkurrerer med acetyl-CoA, der kommer ind i TCA-cyklusen via PDH. I tilstedeværelsen af en alternativ kilde til acetyl-CoA kom alanin således næsten udelukkende ind i TCA-cyklusen via PC-reaktionen. Desuden øgede samtilførsel af alanin med ethanol hastigheden af alaninforbruget via PC-reaktionen med næsten 50 % sammenlignet med lever, der perfunderes med alanin alene. Dette resultat er ikke uventet i lyset af en PC-reaktion, der reguleres af acetyl-CoA-niveauet. En forhøjet koncentration af acetyl-CoA, som den, der var tilgængelig ved ethanolmetabolismen, øgede strømmen gennem PC for at øge oxaloacetatpuljen med henblik på et hurtigere forbrug af acetyl-CoA i TCA-cyklusen. Lignende eksperimenter med mærket pyruvat + NH4C1 og ethanol som substrater blev udført og gav tilsvarende resultater (Cohen, 1987a,b). Endvidere anvendte Nedelec et al. (1990b) den model, som Cohen (1983) havde foreslået, til at vurdere virkningen af virusinduceret myeloproliferativ leukæmi på levermetabolismen. Det blev konstateret, at alaninmetabolismen i inficeret lever hos donorer, der var fastende, var den samme som hos kontrolpersoner, der var spisende. Levere fra begge grupper havde et reduceret bidrag fra PC i forhold til PDH til alaninflux til TCA-cyklusen sammenlignet med fastekontroller. Det ændrede forhold mellem PC/PDH-flow i leukæmisk fastende lever blev forklaret ved den drastisk reducerede tilgængelighed af triglycerider og dermed acetyl-CoA i disse organer.
13C MRS giver den unikke mulighed for at følge metabolismen af ethanol og alanin samtidig (se figur 8). I forsøg, hvor alanin og ethanol blev anvendt som kulstofkilder, blev der produceret acetyl-CoA med to forskellige mærkningsmønstre (Cohen, 1987b). Ved indgang af alanin i TCA-cyklus via PDH-reaktionen dannes acetyl-CoA, og acetyl-CoA stammer fra ethanol. Ud over mærkning af citrat, α-ketoglutarat, glutamat og glutamin ved positionerne C4 og C5 giver inkorporeringen af acetyl-CoA anledning til typiske spin-koblinger mellem de nærliggende kulbrinter C4 og C5 af glutamat og glutamin, som let kan skelnes fra de singletresonanser, der genereres af inkorporeringen af alanin. Der kan derfor opnås et direkte skøn over konkurrencen mellem alanin og ethanol ud fra analysen af forholdet mellem singlet og multiplet i C4 af glutamat. Analysen af spin-koblingsmønstre var også nyttig ved tildelingen af resonanser fra glutathion observeret i 13C MR-spektre opnået fra perfunderet lever (Cohen, 1987a). De spin-koblingsmønstre, der blev påvist for glutamyldelen i glutathion ved leverperfusion med 13C-mærkede prækursorer, svarede nøje til det mærkningsmønster, der blev observeret i glutamat. Det blev således konkluderet, at kulstofskeletet i glutamat forblev intakt og blev direkte inkorporeret i de novo-syntetiseret glutathion. Kemiske forskydninger målt i PCA-ekstrakter af lever viste, at glutathion er til stede i sin reducerede form.
Selvom glutamat blev mærkning af hepatisk glutamin observeret i mange eksperimenter. Dette er ikke overraskende, da glutamin let dannes i glutaminsyntasereaktionen. Cohen et al. (1979b) fulgte tidsforløbet af mærkningsindbygning i hepatisk glutamat og glutamin i muselever perfunderet i nærvær af alanin og mærket eller umærket ethanol. Under alle de undersøgte betingelser var berigelsen i glutamin forsinket i forhold til berigelsen af glutamat, hvilket fremgår af forholdet C4/C2 mellem 13C MR-signalintensiteterne i henholdsvis glutamat og glutamin. Det C4/C2-forhold, der blev observeret i glutamin på et givet tidspunkt, var ikke det samme som det tilsvarende forhold i glutamat, men afspejlede i stedet glutamatforholdet ca. 1 time tidligere. Denne tidsforskel blev anvendt som et mål for strømmen gennem den allosterisk kontrollerede glutaminsyntasereaktion in vivo. Lignende resultater blev opnået fra rottelever perfunderet med acetat (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Fortolkningen af mærkningen i glutamat og glutamin blev imidlertid ført et skridt videre. Forfatterne foreslog, at glutamat og glutamin kunne deltage i en forgæves cyklus, som omfatter aktiviteterne af cytosolisk glutaminsyntase, mitokondriel glutaminase og glutamat/glutaminudveksling på tværs af mitokondriemembranerne.
I fastende lever, der er perfunderet med alanin og ethanol eller pyruvat, ammoniumchlorid og ethanol, kunne aspartat og N-carbamoylaspartat mærket ved C2 og C3 observeres (Cohen, 1987a). Påvisningen af mærket aspartat er ikke uventet, da det let dannes ved transaminering af TCA-cyklusintermediatet oxaloacetat. N-carbamoylaspartat produceres imidlertid i leveren i et af de første trin i de novo pyrimidinnukleotidsyntesen. N-carbamoylaspartat inkorporerer den intakte aspartatdel, hvilket fører til det observerede mærkningsmønster. Den yderligere påvisning af 13C-mærkning i vejens slutprodukter, såsom uridin og dets fosforyleringsprodukter, indikerer, at der blev observeret en nettosyntese af N-carbamoylaspartat, i modsætning til omsætning, i perfunderet lever (Cohen, 1987a).