Restriktionsmodifikation
Restriktionsmodifikationssysteme (RM) sind im Reich der Prokaryoten allgegenwärtig und dienen dort als Abwehrsysteme gegen fremde DNA. Derzeit sind 47 Systeme vom Typ I, 3320 vom Typ II und acht vom Typ III bekannt. R. Roberts (Beverly, MA) wies darauf hin, dass Restriktionsenzyme bis vor kurzem dadurch identifiziert wurden, dass Bakterien aus Kultursammlungen und Umweltproben entnommen und auf Restriktionsaktivität untersucht wurden. Jetzt ist es möglich, neue DNA-Sequenzen auf DNA-Methyltransferase (MTase)-Gene zu untersuchen, die anhand ihrer konservierten Motive identifiziert werden können, und dann nach zugehörigen Genen zu suchen. Diese sind gute Kandidaten für Restriktionsendonukleasegene, da die Gene von DNA-Methyltransferasen und Restriktionsendonukleasen oft miteinander verbunden sind. Bei den jüngsten Genomprojekten wurde auf diese Weise eine unerwartet große Zahl mutmaßlicher RM-Systeme identifiziert. So wurden beispielsweise im Genom von Helicobacter pylori 25 verschiedene MTase-Gene identifiziert, von denen einige mit Restriktionsenzymgenen assoziiert sind. Das Screening von Datenbanken kann daher eine sehr produktive Methode sein, um Restriktionsenzyme mit neuen Spezifitäten zu finden. A. Piekarowicz (Warschau, Polen) berichtete über ein Beispiel für einen solchen Ansatz, der zur Identifizierung eines neuen Typ-IC-Restriktionsenzyms, NgoAXVI, führte.
Typ-I- und Typ-III-Restriktionsenzyme sowie das methylabhängige McrBC-Enzym benötigen zwei Erkennungsstellen und sind für die DNA-Spaltung auf die ATP-Hydrolyse (McrBC: GTP) angewiesen (Übersicht in Rao et al., 2000). Die Spaltung erfolgt, wenn zwei solcher Enzyme bei der Verlagerung der DNA zusammenstoßen, was das Erfordernis zweier Erkennungsstellen erklärt (Abbildung 2).2). T. Bickle (Basel, Schweiz) wies nach, dass Enzyme vom Typ I und McrBC auch zur Spaltung von DNA angeregt werden können, wenn sie auf eine unspezifische Blockade stoßen. Typ-III-Enzyme hingegen werden durch solche Blockaden gehemmt, da jedes translozierende Enzym nur einen Strang schneidet und für die Spaltung beider DNA-Stränge die Kooperation eines anderen Enzyms benötigt.
Abb. 2. Modell für die Aktivierung von Restriktionsenzymen, die ATP (oder GTP) für die DNA-Spaltung benötigen. Nach Bindung zweier Enzymmoleküle (oder Komplexe) an zwei Erkennungsstellen auf einem linearen DNA-Molekül wird die DNA in einem aktiven, energieabhängigen Prozess, der je nach System ATP oder GTP benötigt, verschoben. Dabei wird die DNA herausgeschleift. Die Spaltung erfolgt nach der Kollision zweier translozierender Komplexe an zufälligen Stellen in der Nähe der Erkennungsstellen (Typ-III-Enzyme und McrBC) oder weiter entfernt davon (Typ-I-Enzyme).
Obwohl die meisten Typ-II-Restriktionsenzyme Homodimere sind, die mit einer Kopie ihrer palindromischen Erkennungsstelle interagieren, gibt es Subtypen, die die Zusammenarbeit zweier Stellen erfordern (Übersicht in Pingoud und Jeltsch, 1997). Wie S. Halford (Bristol, UK) feststellte, ist dies nicht nur bei Enzymen des Typs IIe, wie NaeI, sondern auch bei Enzymen des Typs IIf, wie SfiI, und Enzymen des Typs IIS, wie FokI, der Fall. Enzyme vom Typ IIf sind Homotetramere mit zwei getrennten DNA-Bindungsstellen, die jeweils von zwei Untereinheiten gebildet werden. SfiI ist nur aktiv, wenn beide DNA-Bindungsstellen besetzt sind, was zu einer gleichzeitigen Spaltung beider Stellen führt. Für FokI, das aus einer Spaltungs- und einer Erkennungsdomäne besteht, wurde bereits gezeigt, dass eine Dimerisierung des Enzyms auf der DNA erforderlich ist, damit die Spaltung stattfinden kann. Halford hat nun gezeigt, dass für eine effiziente Spaltung zwei Erkennungsstellen erforderlich sind, da jede der Erkennungsdomänen mit einer Erkennungssequenz interagieren muss. Alle drei Enzymtypen wirken optimal mit zwei Erkennungsstellen auf derselben DNS, wobei sie die DNS zwischen den Stellen in einer Schleife einschließen.
Typische Restriktionsenzyme vom Typ II werden weiterhin entdeckt. BbvCI ist ein heterodimeres Restriktionsenzym, das eine asymmetrische Sequenz erkennt. Die Untereinheiten sind einzeln inaktiv, aber gemeinsam aktiv. Dadurch ist es möglich, spezifische Nicking-Enzyme zu erzeugen, indem eine Untereinheit durch ortsgerichtete Mutagenese inaktiviert wird, wie von G. Wilson (Beverly, MA) berichtet wurde. A. Janulaitis (Vilnius, Litauen) erzielte ein ähnliches Ergebnis für das heterodimere Restriktionsenzym Bpu10I. Außerdem gelang es ihm, die Substratspezifität von Eco57I, einem monomeren Restriktions- und Modifikationsenzym, das nur eine einzige Zielerkennungsdomäne besitzt, zu lockern. In dieser Studie wurde durch Zufallsmutagenese eine Variante erzeugt, die nicht nur mit der kanonischen CTGAAG-Stelle, sondern auch mit CTGGAG-Stellen interagiert. Die molekulare Grundlage für diese gelockerte Spezifität muss noch ermittelt werden. V. Siksnys (Vilnius, Litauen) berichtete über die Entdeckung eines neuen Restriktionsenzyms vom Typ IIs, BfiI, das für die Spaltung nicht auf zweiwertige Metallionen angewiesen ist. Dieses Enzym zeigt Sequenzähnlichkeit mit einer unspezifischen Nuklease aus Salmonella typhimurium und verwendet vermutlich einen ähnlichen katalytischen Mechanismus.
A. Pingoud (Giessen, Deutschland) diskutierte den Mechanismus der DNA-Spaltung durch Typ-II-Restriktionsenzyme und Homing-Endonukleasen, die zwar eine gemeinsame Funktion haben, aber im Allgemeinen unterschiedliche Strukturen aufweisen und vermutlich unterschiedlichen Spaltungsmechanismen folgen. Obwohl für viele Restriktionsenzyme, die ein gemeinsames katalytisches Motiv aufweisen, detaillierte Strukturinformationen verfügbar sind, gibt es keinen Konsens über den katalytischen Mechanismus oder die Anzahl der an der Katalyse beteiligten Mg2+-Ionen. Im Prinzip gilt das Gleiche für andere Phosphoryltransferasen mit einem Restriktionsenzym-ähnlichen katalytischen Zentrum. Beispiele für solche Proteine sind das Vsr-Reparaturenzym (E. coli) und die Hjc-Resolvase (Pyrococcus furiosus). Die Kristallstruktur des letztgenannten Enzyms wurde von K. Morikawa (Osaka, Japan) vorgestellt (Abbildung 3).3). Im Gegensatz dazu scheint der Mechanismus der DNA-Spaltung durch die homing endonucleases der HNH-Familie, z.B. I-PpoI, besser geklärt zu sein, da strukturelle Informationen für das freie Enzym sowie für Enzym-Substrat- und Enzym-Produkt-Komplexe verfügbar sind, zusätzlich zu detaillierten biochemischen Informationen für dieses und verwandte Enzyme der „ββα-Me-Finger“-Superfamilie. Diese Enzyme benötigen ein Mg2+-Ion als Cofaktor, das an ein konserviertes Asn gebunden ist. Das angreifende Hydroxyl-Ion wird durch ein konserviertes His erzeugt, die Stabilisierung des Übergangszustands erfolgt durch ein konserviertes Arg und die Protonierung der Abgangsgruppe wird durch ein Wassermolekül aus der Hydratationssphäre des Mg2+-Ions ermöglicht.
Abbildung 3. Vergleich der Restriktionsendonuklease-Faltungen von Hjc und Vsr als Beispiel für die Strukturerhaltung bei Enzymen mit verwandten Funktionen. Die Banddiagramme von Hjc und Vsr sind nach Überlagerung der beiden Strukturen in der gleichen Ausrichtung dargestellt. Die Seitenketten der Reste des aktiven Zentrums sind hervorgehoben, und die beiden konservierten Asp-Reste sind markiert. Diese Abbildung wurde freundlicherweise von T. Nishino und K. Morikawa zur Verfügung gestellt.
Bakterien haben RM-Systeme zur Bekämpfung von Bakteriophagen entwickelt. Diese wiederum haben verschiedene Mittel entwickelt, um der Restriktion durch bakterielle RM-Systeme zu entgehen. D. Dryden (Edinburgh, UK) berichtete über die Ergebnisse einer biochemischen Analyse des Proteins Gen 0.3 des Bakteriophagen T7, das ein Inhibitor von Restriktionsmodifikationsenzymen vom Typ I ist. Dieses Protein bindet stöchiometrisch an das Restriktionsenzym und füllt aufgrund seiner verlängerten Form und negativen Oberflächenladung vermutlich die DNA-Bindungsstelle des Enzyms vollständig aus und verhindert dadurch die DNA-Bindung.
RM-Systeme bestehen aus Restriktionsendonukleasen und DNA-Methyltransferasen (MTasen) (besprochen in Cheng, 1995; Robertson und Wolffe, 2000). Da jedoch das Muster der DNA-Methylierung der DNA Informationen hinzufügt und dadurch ihre Codierungskapazität erweitert, sind MTasen nicht nur die Begleiter der Restriktionsenzyme in RM-Systemen, sondern haben viele andere wichtige Funktionen. In Prokaryonten spielen sie eine Rolle bei der DNA-Reparatur und bei der Regulierung der Genexpression und DNA-Replikation. Bei Eukaryonten führt die DNA-Methylierung im Allgemeinen zur transkriptionellen Stilllegung von Genen. Sie trägt zu epigenetischen Prozessen wie der Inaktivierung des X-Chromosoms, dem Imprinting und der Genregulation bei. Mit der Entdeckung, dass mehrere DNA-MTasen für die Entwicklung von Mäusen unerlässlich sind, hat sich die Bedeutung der DNA-Methylierung weitgehend durchgesetzt.
X. Cheng (Atlanta, GA) stellte die Struktur des Dnmt2-Proteins vor, die die erste Struktur einer eukaryotischen DNA-MTase sein könnte. Das Protein hat eine MTase-Faltung und besitzt alle charakteristischen katalytischen Motive, scheint aber keine katalytische Aktivität zu besitzen. Dies wirft Fragen auf wie die, ob es sich tatsächlich um ein Enzym handelt und was sein Substrat ist (DNA, RNA oder etwas anderes). Weitere Diskussionen über eukaryotische Enzyme von Cheng und A. Jeltsch (Gießen, Deutschland) befassten sich mit den Enzymen Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b. Beide Referenten berichteten über Ergebnisse, die mit verkürzten Proteinen und isolierten Domänen dieser riesigen Enzyme (die bis zu 1700 Aminosäurereste umfassen) erzielt wurden, und präsentierten Ergebnisse zur enzymatischen Analyse der gereinigten Enzyme. Da die katalytische Domäne von Dnmt1 (∼500 Aminosäurereste) in isolierter Form nicht aktiv ist, muss sie unter enger Kontrolle der anderen Teile des Enzyms stehen. Diese Interaktion könnte erforderlich sein, um eine hohe Spezifität für hemimethylierte DNA zu gewährleisten. Trotz der Fortschritte auf diesem Gebiet ist der Prozess der DNA-Methylierung in Eukaryonten, insbesondere die Mechanismen, die das Muster der DNA-Methylierung erzeugen, immer noch schlecht verstanden.
Etwas mehr ist über die DNA-Methylierung in Prokaryonten bekannt. R. Gumport (Urbana, IL) stellte die Struktur der prokaryotischen M.RsrI MTase vor und bestätigte damit die Vermutung, dass die katalytischen Domänen aller MTasen eine gemeinsame Architektur aufweisen. S. Klimasauskas (Vilnius, Litauen), D.N. Rao (Bangalore, Indien), Gumport und Jeltsch diskutierten die molekulare Enzymologie von vier prokaryotischen MTasen (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI und M.EcoRV). Der katalytische Zyklus dieser Enzyme umfasst die Bindung von DNA und Kofaktoren, die Lokalisierung und Erkennung der Zielstelle sowie Konformationsänderungen des Komplexes, einschließlich Basenflipping und Methylgruppentransfer (Abbildung 4).4). Es wurden Unterschiede im Detail deutlich, z. B. die Reihenfolge der Substrat- und Kofaktorbindung und der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt unterscheiden sich bei den verschiedenen MTasen. 2-Aminopurin erwies sich als gutes Werkzeug zur Analyse der Kinetik der Konformationsänderungen, die die DNA im Komplex mit MTasen erfährt, einschließlich des Basenflippings.
Abb. 4. Mechanismus der Zielstellenfindung durch Restriktionsendonukleasen und DNA-Methyltransferasen. Zunächst wird die DNA unspezifisch gebunden, dann wird die Zielstelle durch erleichterte Diffusion (Gleiten und Springen) auf der DNA lokalisiert. Kontakte zu den Zielstellen führen zu Konformationsänderungen des Enzyms und der DNA, die wiederum die Katalyse auslösen. Dieser Mechanismus ist den meisten Enzymen gemein, die spezifisch mit der DNA interagieren.