Unterscheidung zwischen Wildschwein und Hausschwein in Lebensmitteln durch gezielten Einsatz von Echtzeit-PCR

Primer- und Sondendesign

Für das Primer- und Sondendesign haben wir Polymorphismen ausgewählt, von denen bereits berichtet wurde, dass sie die Unterscheidung zwischen Wildschwein und Hausschwein ermöglichen. Wir begannen mit dem SNP g.299084751 C > T im NR6A1-Gen, der mit der Anzahl der Brust- und Lendenwirbel in Verbindung gebracht wurde: Wildschweine, die homozygot für das Wildtyp-Allel g.299084751 C sind, haben 19 Wirbel, während Hausschweine, die homozygot für g.299084751 T sind, 21-23 Wirbel haben. In der Studie von Fontanesi et al. wurde dieser SNP zur Unterscheidung von Wildschwein und Hausschwein mittels PCR-RFLP10 verwendet. Unser Ziel war es, ein Primerpaar für die Amplifikation der Zielregion sowohl beim Wildschwein als auch beim Hausschwein zu entwickeln, sowie zwei TaqMan-Sonden, die für das Wildschwein-Allel (g.299084751 C) bzw. das Hausschwein-Allel (g.299084751 T) spezifisch sind. Der Duplex-Assay sollte es ermöglichen, Wildschwein und Hausschwein gleichzeitig in ein und derselben Vertiefung nachzuweisen. Insgesamt entwarfen wir vier Vorwärtsprimer, drei Rückwärtsprimer, vier Wildschwein-Sonden und eine Hausschwein-Sonde und kombinierten sie zu 21 Primer/Sonden-Systemen (Chr1a – u, ergänzende Tabelle 1). Das Primer-/Sondensystem Chr1a zielte auf den oberen Strang, die Primer-/Sondensysteme Chr1b-u auf den unteren Strang des NR6A1-Gens. In einer Reihe von Experimenten untersuchten wir, ob die Primer-/Sondensysteme spezifisch für Wildschweine waren oder eine Kreuzreaktivität mit Hausschweinrassen/Kreuzungen aufwiesen. Das Primer-/Sondensystem Chr1a führte zu einem ΔCt-Wert ≥ 10,56 zwischen Hausschwein und Wildschwein (ergänzende Tabelle 2). Für die Primer-/Sondensysteme Chr1i – o lagen die ΔCt-Werte zwischen 8,65 und 11,19. Die Primer/Sondensysteme Chr1b – h und Chr1p – t führten bei Hausschweinrassen/Kreuzungen nicht zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals. Da das Primer-/Sondensystem Chr1q den niedrigsten Ct-Wert (24,77; n = 2) für Wildschweine ergab, testeten wir seine Anwendbarkeit in Kombination mit einer TaqMan-Sonde für Hausschweine im Duplex-Assay-Format (Primer-/Sondensystem Chr1u, ergänzende Tabelle 1). Da die Ct-Werte sowohl beim Wildschwein (26,21, n = 2) als auch beim Hausschwein (27,90, n = 2) zufriedenstellend waren, wurden alle weiteren PCR-Experimente für den SNP g.299084751 C > T mit dem Primer/Sonden-System Chr1u durchgeführt. Im Folgenden wird der Duplex-Echtzeit-PCR-Assay als assayChr1 bezeichnet, bestehend aus dem Assay für Hausschweine, assayChr1D, mit dem Vorwärtsprimer Chr1f4, dem Rückwärtsprimer Chr1r2 und der Sonde Chr1p1D, und dem Assay für Wildschweine, assayChr1W, mit dem Vorwärtsprimer Chr1f4, dem Rückwärtsprimer Chr1r2 und der Sonde Chr1p4W (Abb. 1A).

Teilsequenzen von (A) dem NR6A1-Gen auf Chromosom 1 mit SNP g.299084751 C > T, auf das der Duplex-Assay „assayChr1“ abzielt, und (B) Chromosom 9, das den SNP g.118314929 A > G (rs81416363) trägt, auf den die beiden Singleplex-Assays „assayChr9D“ und „assayChr9W“ abzielen. Die Pfeile zeigen die Positionen der Primer (dunkelgrau) und Sonden (hellgrau) an. (A) Der Duplex-AssayChr1 umfasste den Vorwärtsprimer Chr1f4, den Rückwärtsprimer Chr1r2, die Sonde Chr1p4W und die Sonde Chr1p1D. (B) Singleplex-AssayChr9D umfasste Vorwärtsprimer Chr9f8, Rückwärtsprimer Chr9r17D und Sonde Chr9p2; Singleplex-AssayChr9W umfasste Vorwärtsprimer Chr9f8, Rückwärtsprimer Chr9r12W und Sonde Chr9p2. Subspezies-spezifische Basen sind fett gedruckt (vertikale rote Pfeile) und Mismatch-Basen blau (vertikale blaue Pfeile).

Da wir aus der Literatur gelernt hatten, dass die Unterscheidungskraft durch die Ausrichtung auf nur einen Polymorphismus höchstwahrscheinlich nicht ausreichend ist, suchten wir nach einem weiteren geeigneten Genort. Bei der Untersuchung von 20 SNPs auf ihre Eignung zur Unterscheidung zwischen Wildschwein und Hausschwein hatten Beugin et al. festgestellt, dass die SNPs rs80864596 (intergenisch, Chromosom 5), rs80796712 (Glykogensynthasekinase 3-beta, Chromosom 13) und rs81416363 (intergenisch, Chromosom 9) die höchste Unterscheidungskraft aufweisen11. Daher haben wir diese drei SNPs für die Entwicklung von Primer-/Sondensystemen ausgewählt. Im Vergleich zum Primer-/Sondendesign für den SNP g.299084751 C > T verfolgten wir eine andere Strategie. Anstatt die subspezies-spezifische Base in der Sonde zu platzieren, platzierten wir sie an der vorletzten Stelle vom 5′-Ende des Vorwärts- oder Rückwärtsprimers. Um die Spezifität zu erhöhen, haben wir absichtliche Basenfehlpaarungen eingeführt. Diese so genannte Mismatch-Amplification-Mutation-Assay (MAMA)-Technik12,13 hat den Vorteil, dass sie recht kosteneffizient ist, da ein und dieselbe Sonde mit einer Reihe von Primern getestet werden kann, die sich in der Position der Fehlpaarung unterscheiden. In den ersten Versuchsreihen führten wir die Mismatch-Base entweder an der 3′- oder an der 6. Position vom 3′-Ende des Primers ein, der die subspezies-spezifische Base trägt. Bei der Entwicklung von Echtzeit-PCR-Assays für Rot-, Dam- und Sikahirsche14,15,16 hatte sich diese Strategie als erfolgreich erwiesen. In der vorliegenden Studie erlaubte jedoch keines der Primer/Sonden-Systeme (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, ergänzende Tabelle 1) die Unterscheidung zwischen Hausschwein und Wildschwein (ergänzende Tabelle 3). Die besten Ergebnisse (ΔCt-Wert zwischen Hausschweinrassen/Kreuzungen und Wildschwein ≥5,24) wurden mit dem Primer/Sondensystem Chr9j erzielt. Bei diesem Primer/Sonden-System, das auf den SNP rs81416363 auf Chromosom 9 abzielt, befand sich die Mismatch-Base an der dritten Position vom 3′-Ende des Primers (TTCACG → TTCCCG). Um die Spezifität zu erhöhen, führten wir eine weitere Fehlpaarung an der 4. (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) oder 5. Position (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) vom 3′-Ende des Primers ein. Die Einführung zusätzlicher Mismatches erwies sich als erfolgreich. Mit dem Primer/Sondensystem Chr9r (ergänzende Tabelle 1) erhielten wir sowohl den niedrigsten Ct-Wert für Wildschweine (22,09; n = 2) als auch den höchsten ΔCt-Wert (10,52) zwischen Hausschweinrassen/Kreuzungen und Wildschweinen (ergänzende Tabelle 3). Dieser Echtzeit-PCR-Assay für Wildschweine, der auf den SNP rs81416363 auf Chromosom 9 abzielt, basierte auf dem Primer/Sonden-System Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Als Nächstes wendeten wir die MAMA-Strategie an, um den entsprechenden Echtzeit-PCR-Assay, der auf den SNP rs81416363 auf Chromosom 9 abzielt, für Hausschweine zu entwickeln. Wir lokalisierten die Hausschwein-spezifische Base an der vorletzten Base vom 5′-Ende des Primers und die Mismatch-Base an der 3′-Position vom 3′-Ende (Primer/Sondensysteme Chr9v – x; ergänzende Tabelle 1). Die Einführung einer Mismatch-Base reichte jedoch nicht aus, um eine Unterscheidung zwischen Hausschwein und Wildschwein zu ermöglichen. Die Einführung von Mismatch-Basen an der 3. und 5. Position vom 3′-Ende des Primers (Primer-/Sondensysteme Chr9y – ag) führte zu einem ΔCt-Wert ≥ 4,83. Befanden sich die Fehlpaarungen an den Positionen 3 und 4 (Primer/Sondensysteme Chr9ah – aj), betrug der ΔCt-Wert ≥5,85. Durch die Einführung von drei aufeinanderfolgenden Fehlpaarungen neben der subspezies-spezifischen Base (Primer-/Sondensysteme Chr9ak – am) konnte die Spezifität erhöht werden. Das Primer-/Sondensystem Chr9ak, bei dem die Fehlpaarungen an den Positionen 3, 4 und 5 lagen (TTCATG → TGGTTG), führte zum höchsten ΔCt-Wert von ≥9,97. Daher wurden alle weiteren Experimente mit dem Primer/Sonden-System Chr9ak durchgeführt. Im Folgenden werden die beiden Singleplex-Assays, die auf den SNP rs81416363 auf Chromosom 9 abzielen, als assayChr9D bezeichnet, das den Vorwärtsprimer Chr9f8, den Rückwärtsprimer Chr9r17D und die Sonde Chr9p2 umfasst, und assayChr9W, das den Vorwärtsprimer Chr9f8, den Rückwärtsprimer Chr9r12W und die Sonde Chr9p2 umfasst (Abb. 1B).

Optimierung der Primer/Sonden-Konzentration und des Verhältnisses

Alle oben dargestellten Ergebnisse wurden mit Primer- und Sondenkonzentrationen von 500 nM und 200 nM (Primer/Sonden-Systeme, die auf Chromosom 1 abzielen) bzw. 200 nM und 100 nM (Primer/Sonden-Systeme, die auf Chromosom 5, 9 und 13 abzielen) erzielt. Als Nächstes untersuchten wir, ob die Spezifität der Echtzeit-PCR-Assays durch Optimierung der Primer/Sonden-Konzentration und des Verhältnisses erhöht werden kann. Im Fall von assayChr1 wurde festgestellt, dass die optimale Primer- und Sondenkonzentration bei 1.000 nM bzw. 200 nM liegt (ergänzende Tabelle 4). Im Falle von assayChr9W und assayChr9D führte ein Überschuss an Primer, der sowohl die subspezies-spezifische Base als auch die Mismatch-Basen trägt, zu höheren ΔCt-Werten zwischen der kreuzreagierenden Subspezies und der Zielspezies. Die höchste Selektivität von assayChr9W und assayChr9D wurde mit Vorwärtsprimer/Rückwärtsprimer/Sonde-Konzentrationen von 12,5/200/50 nM bzw. 62,5/800/50 nM erreicht.

Kreuzreaktivitätstests

Als nächstes führten wir Kreuzreaktivitätstests mit DNA-Isolaten von Wildschweinen, verschiedenen Hausschweinrassen/Kreuzungen und weiteren 22 Tierarten durch, die in der ergänzenden Tabelle 5 aufgeführt sind. Abbildung 2A-D zeigen die mit assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W bzw. assayChr1D erhaltenen Amplifikationskurven. AssayChr9W zeigte eine leichte Kreuzreaktivität mit Hausschweinen, Sikahirschen, Alpensteinböcken, Schafen, Ziegen und Gämsen (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D mit Wildschweinen, Sikahirschen, Elchen, Pferden und Puten (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Im Gegensatz zu den Assays, die auf den SNP rs81416363 auf Chromosom 9 abzielen, zeigte assayChr1 keine Kreuzreaktivität (mit Ausnahme von assayChr1W für Rehwild in nur einem von vier Replikaten). Wir analysierten auch DNA-Isolate von 50 Pflanzenarten, die üblicherweise als Lebensmittelzutaten verwendet werden (ergänzende Tabelle 6). Bei keinem der Assays wurde eine Kreuzreaktivität mit einer der Pflanzenarten festgestellt.

Ergebnisse der Kreuzreaktivitätstests mit DNA-Isolaten (10 ng/µL) von 22 Tierarten und Wildschwein/Hausschwein. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W und (D) assayChr1D.

Überprüfung verschiedener kommerzieller Mastermixe auf ihre Anwendbarkeit

In einer nächsten Versuchsreihe untersuchten wir, ob die Art des kommerziellen Mastermixes die Selektivität der Assays beeinflusst. Wir analysierten DNA-Isolate von 23 Tierarten, darunter 3 Wildschweinindividuen und 11 Rassen/Kreuzungen von Hausschweinen, mit insgesamt fünf Mastermixen von verschiedenen Anbietern. Die Mastermixe und die jeweiligen Temperaturprogramme sind in der ergänzenden Tabelle 7 aufgeführt. Im Allgemeinen beeinflusste die Art des Mastermixes sowohl die absoluten Ct-Werte als auch die ΔCt-Werte zwischen Ziel- und kreuzreagierenden (Unter-)Arten. Die Echtzeit-PCR-Assays wurden jedoch in unterschiedlichem Maße beeinflusst. Im Falle von assayChr9W beispielsweise ergaben Mix 2 und 3 höhere Ct-Werte als Mastermix 1 (der Standard-Mastermix in der vorliegenden Studie), 4 und 5 (Ct ± SD (n = 6): Mix 1: 25,03 ± 0,15; Mix 2: 31,17 ± 1,70; Mix 3: 28,43 ± 0,13; Mix 4: 26,64 ± 0,10; Mix 5: 26,64 ± 0,17). Beim AssayChr9D hatte der Typ des Mastermixes einen Einfluss auf die ΔCt-Werte und damit auf die Selektivität des Assays. Die mit Mastermix 1, 2, 3 und 4 erzielten ΔCt-Werte betrugen ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 bzw. ≥ 5,86, während mit Mastermix 5 überhaupt keine Kreuzreaktivität beobachtet wurde. Im Falle des AssayChr1 wurden mit den Mastermixen 1, 3 und 4 recht ähnliche Ct-Werte erzielt. Mit den Master-Mixen 2 und 5 wurden jedoch keine Produkte gebildet, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass diese Mixe nicht für das Multiplexing geeignet sind. Aufgrund dieser Ergebnisse empfehlen wir dringend, die Anwendbarkeit zu testen, wenn eine andere Art von Mastermix verwendet werden soll.

Robustheit

Die Robustheit der Real-Time-PCR-Assays wurde untersucht, indem die Annealing-Temperatur ±1 °C und das Volumen des Reaktionsmixes pro Vertiefung um ±5% variiert und zwei verschiedene Real-Time-PCR-Cycler verwendet wurden. Die Versuche wurden mit DNA-Isolaten von Wildschweinen, Hausschweinen und Rehen durchgeführt. Für assayChr9W und assayChr9D waren die Ct-Werte sehr ähnlich zu denen, die unter Standardbedingungen erhalten wurden (ΔCt-Werte <1,00), außer wenn die Annealing-Temperatur auf 61 °C erhöht wurde (ΔCt-Werte ≤2,16 bzw. ≤1,57). Mit ΔCt-Werten ≤0,77 erwies sich assayChr1 als noch robuster. Weder eine Verkleinerung des Gesamtreaktionsvolumens noch die Verwendung eines anderen Real-Time-PCR-Cyclers beeinflussten die Ct-Werte wesentlich, was die Robustheit der Real-Time-PCR-Assays belegt.

Arbeitsbereich, linearer Bereich und Amplifikationseffizienz

Bei der Analyse eines Wildschwein-DNA-Isolats (211 µg/mL) und zweier Hausschwein-DNA-Isolate (158 µg/mL und 160 µg/mL), seriell verdünnt in Wasser (1:2-1:524,288), waren assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W und assayChr1D zwischen 211 µg/mL und 13 ng/mL linear (R2 = 0.9948), 158 µg/mL und 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL und 6 ng/mL (R2 = 0,9994) bzw. 160 µg/mL und 10 ng/mL (R2 = 0,9988) (Abb. 3A). Die aus den Steigungen der Standardkurven berechneten Amplifikationseffizienzen betrugen 83 %, 96 %, 93 % bzw. 95 %. Darüber hinaus wurde der Linearitätsbereich durch die Analyse von seriell mit Heringssperma-DNA verdünnten Wildschwein- und Hausschwein-DNA-Isolaten bewertet. Für assayChr9W und assayChr9D reichte die Linearität von 20 µg/mL bis 20 ng/mL (R2 = 0,9988) bzw. 20 µg/mL bis 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (Abb. 3B). Im Falle von assayChr1W und assayChr1D lag die Linearität im Bereich von 20 µg/mL bis 5 ng/mL (R2 = 0,9978) bzw. 20 µg/mL bis 10 ng/mL (R2 = 0,9988). Die aus den Steigungen der Standardkurven berechneten Amplifikationseffizienzen betrugen 76%, 90%, 97% bzw. 101%.

Bereich der Linearität der vier Assays, (A) bestimmt in Wasser als Hintergrund und (B) bestimmt in Heringssperma-DNA als Nicht-Ziel-Hintergrund-DNA.

Diese Ergebnisse zeigen, dass der Arbeitsbereich der Echtzeit-PCR-Assays fast identisch ist, während der Linearitätsbereich für die Assays, die auf Chromosom 9 abzielen, schmaler ist als für die Assays, die auf Chromosom 1 abzielen. Alle Amplifikationseffizienzen lagen zwischen 90 % und 110 %, wie in den ENGL-Leitlinien17 empfohlen, mit Ausnahme des Assays Chr9W (83 % in Wasser, 76 % in Heringssperma-DNA). Die geringere Amplifikationseffizienz von assayChr9W ist höchstwahrscheinlich auf eine verringerte Primerbindungsstabilität aufgrund der Mismatches zurückzuführen, die zur Erhöhung der Selektivität für die Zieltierart eingeführt wurden.

Limit of Detection (LOD) in Heringssperma-DNA und Schweine-DNA als Hintergrund-DNA

Die LOD wurde als die niedrigste DNA-Konzentration definiert, die bei mindestens 19 von 20 Wiederholungen zu einem Anstieg des Fluoreszenzsignals führte. Darüber hinaus sollte der Ct-Wert unter dem Ct-Wert liegen, der für kreuzreagierende Spezies ermittelt wurde.

Bei Heringssperma-DNA wurde die LOD des AssaysChr9D (1,0 %, w/w, Abb. 4A) war etwas höher als die LOD der anderen drei Assays (0,2 %, w/w, Abb. 4B-D). Die höhere LOD des AssaysChr9D ist auf die Kreuzreaktivität mit Wildschwein zurückzuführen (ΔCt-Wert zwischen Wildschwein und Hausschwein nur ≥8,41).

Bestimmung der LOD durch Analyse serieller Verdünnungen von (A-D) DNA-Mischungen, die Wildschwein- oder Hausschwein-DNA in Heringssperma-DNA enthalten und (E-H) einer DNA-Mischung, die Wildschwein-DNA in Hausschwein-DNA oder Hausschwein-DNA in Wildschwein-DNA als Hintergrund-DNA enthält. (A,E) wurden mit assayChr9D, (B,F) mit assayChr9W, (C,G) mit assayChr1D und (D,H) mit assayChr1W ermittelt. Die Messungen wurden in 20 Wiederholungen durchgeführt. Die Kreise stellen individuelle Ct-Werte dar, die horizontalen Linien geben die Mittelwerte an.

Darüber hinaus haben wir die LOD der Echtzeit-PCR-Assays für Wildschwein, assayChr1W und assayChr9W, in Hausschwein-DNA als Hintergrund und die der Assays für Hausschwein, assayChr1D und assayChr9D, in Wildschwein-DNA als Hintergrund bestimmt. Bei 2%, 0,2%, 5% und 2% (w/w) waren die LODs von assayChr9D (Abb. 4E), assayChr9W (Abb. 4F), assayChr1D (Abb. 4G) und assayChr1W (Abb. 4H) recht unterschiedlich. Die höhere LOD von assayChr1D in Anwesenheit von Wildschwein-DNA wurde durch eine Signalunterdrückung verursacht, die höchstwahrscheinlich auf die Konkurrenz der beiden Sonden um die Zielsequenz im Duplex-Assay-Format zurückzuführen ist. Um die Signalsuppression genauer zu untersuchen, wurden neben den Positivkontrollen (Wildschwein-DNA bzw. Hausschwein-DNA) auch DNA-Mischungen analysiert, die entweder 25% (w/w) Wildschwein-DNA in Hausschwein-DNA oder 25% (w/w) Hausschwein-DNA in Wildschwein-DNA enthielten.

Beim Vergleich der Positivkontrollen mit den 1:4 verdünnten Standards, die Nicht-Ziel-DNA enthielten, konnten wir keinen Unterschied in den Amplifikationskurven (ΔRn-Werte) für assayChr9W und assayChr9D feststellen (Abb. 5A,B). Im Falle von assayChr1W und assayChr1D waren die für die Positivkontrolle erhaltenen Fluoreszenzsignale (ΔRn-Werte) jedoch höher als die für den 1:4 verdünnten Standard bei gleicher Ziel-DNA-Konzentration (Abb. 5C,D).

Amplifikationskurven (in halblogarithmischer Darstellung), die für DNA-Mischungen (20 ng/µL) erhalten wurden, die 25 % (Gew./Gew.) der Zielunterart (Wildschwein oder Hausschwein) und 75 % (Gew./Gew.) der Nicht-Zielunterart (Wildschwein oder Hausschwein) und deren serielle Verdünnungen (1:4 bis 1:1.024) enthalten. DNA-Isolate (5 ng/µl) von Wildschwein bzw. Hausschwein wurden als Kontrollen verwendet. AssayChr9W (A) und assayChr9D (B) zeigen Kreuzreaktivität mit der Nicht-Ziel-Subspezies. AssayChr1W (C) und assayChr1D (D) zeigen eine Signalunterdrückung in Gegenwart der Nicht-Ziel-Subspezies.

Wiederholbarkeit

Die Wiederholbarkeit der Real-Time-PCR-Assays wurde untersucht, indem Fleischextraktmischungen, die 30 % (w/w) Ziel-DNA und 70 % (w/w) Nicht-Ziel-Subspezies-DNA sowie serielle Verdünnungen davon enthielten, fünfmal an vier verschiedenen Tagen in Duplikaten analysiert wurden. Die RSD der Ct-Werte war ≤1,0 % (assayChr1W), ≤1,9 % (assayChr9W), ≤2,3 % (assayChr1D) und ≤3,5 % (assayChr9D), was die hohe Wiederholbarkeit der Tests belegt.

Analyse von Proben von Wildschwein- und Hausschwein-Individuen

Die Real-Time-PCR-Assays wurden für die Analyse von Proben von 64 Hausschwein-Individuen angewendet, darunter 14 Rassen und 6 Kreuzungen (Abb. 6A). Darüber hinaus wurden insgesamt 30 Wildschweinproben aus 5 verschiedenen Ländern (Österreich, Estland, Deutschland, Rumänien und USA, Abb. 6B) analysiert. Bei einem Wildschweinindividuum aus Europa war die genaue Herkunft unbekannt. Jede Probe wurde in mindestens vier Wiederholungen analysiert. Zu jeder PCR-Platte wurde eine Positivkontrolle (DNA-Mischung, 10 ng/µl) hinzugefügt, die die Zielunterart in der gleichen Konzentration wie die LOD enthielt und den Cut-off-Ct-Wert lieferte.

Ergebnisse für (A) 64 Hausschwein- und (B) 30 Wildschweinproben. Die Messungen wurden in mindestens vier Wiederholungen durchgeführt.

Bei der Analyse der Positivkontrollen in 14 Wiederholungen betrug der Mittelwert ± SD der Ct-Werte 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) und 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). Mit Ausnahme von assayChr9D wurden alle Proben, die zu höheren Ct-Werten führten, als <LOD betrachtet. Im Falle von assayChr9D wurden für mehrere Wildschweinproben Ct-Werte ≥ 34,61 erzielt. Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse zu verringern, setzten wir den Cut-off-Ct-Wert von assayChr9D auf 34,00. Für die Anwendung von assayChr9W und assayChr9D in der Routineanalytik empfehlen wir die Verwendung einer Positivkontrolle, bestehend aus 2 % (w/w) Hausschwein-DNA, 0,2 % (w/w) Wildschwein-DNA und 97,8 % (w/w) Heringssperma-DNA.

Bei der Analyse von Hausschweinproben mit assayChr9D erhielten wir 63 positive und nur ein negatives Ergebnis (Mangalica 1) (Abb. 6). Von den 12 Cinta Senese-Individuen analysierten wir zwei verschiedene Fleischteile, eine magere Probe (vom Longissimus dorsi) und eine subkutane Rückenfettprobe (vom Lendenstück) (Daten nicht gezeigt). Die für die mageren Proben ermittelten Ct-Werte (mittlerer Ct ± SD von 25,24 ± 0,44, n = 48) waren denen der subkutanen Rückenspeckproben (26,29 ± 0,35, n = 48) sehr ähnlich. Als wir die 30 Wildschweinproben mit assayChr9D analysierten, führten 21 nicht zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals, aber neun Individuen (eines aus Österreich, fünf aus Deutschland und drei aus den USA) wurden als Hausschwein identifiziert.

Mit assayChr9W wurde die Mehrheit der Wildschweinproben korrekt zugeordnet, nur für drei Proben (eine aus Deutschland und zwei aus den USA) erhielten wir negative Ergebnisse. Allerdings führte assayChr9W auch bei einigen Hausschweinen zu positiven Ergebnissen, darunter ein Bentheimer Schwarzkittel, drei Krškopolje- und drei Mangalica-Schweine. Insbesondere die drei Mangalica-Schweine aus Österreich wurden als Hausschweine identifiziert, während die drei Tiere aus Deutschland als Wildschweine identifiziert wurden. Bei AssayChr9, einschließlich AssayChr9W und AssayChr9D, führten 12 der 94 Fleischproben zu uneindeutigen Ergebnissen, da mit beiden Real-Time-PCR-Assays ein Anstieg des Fluoreszenzsignals erzielt wurde. Außerdem wurde ein Mangalica-Schwein als Wildschwein und drei Wildschweinindividuen als Hausschwein identifiziert.

In der Studie von Beugin et al.11 wurde die Eignung des SNP rs81416363 an „reinen“ Wildschweinen, die in einem Naturpark in den Vogesen in Frankreich gejagt wurden, und einer begrenzten Anzahl kommerzieller Schweinerassen (Landrasse, Large White, Piétrain und Duroc) getestet. Es wurde festgestellt, dass Wildschweine das G-Allel tragen (Häufigkeit 100 %, keine Heterozygotie) und Hausschweine das A-Allel (Häufigkeit 98 %, Heterozygotie 5 %).

Um herauszufinden, warum assayChr9W und assayChr9D zu mehreren Fehlklassifizierungen und einigen uneindeutigen Ergebnissen führten, haben wir die entsprechenden Wildschwein- und Hausschweinproben mittels hochauflösender Schmelzanalyse (HRM) genotypisiert. Wir haben die HRM-Analyse angewandt, weil sie eine leistungsstarke, zeit- und kosteneffiziente Technik für die SNP-Genotypisierung ist18. Die normalisierten Schmelzkurven (Abb. 7A) zeigen, dass der homozygote G-Genotyp nicht nur für die Wildschweinproben gefunden wurde, sondern auch für die Mangalica-Probe (Probe 1), für die ein Anstieg des Fluoreszenzsignals mit assayChr9W, aber nicht mit assayChr9D erhalten wurde. Bei den Wildschweinproben, die mit assayChr9D zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals führten, wurde festgestellt, dass sie mindestens eine Kopie des A-Allels tragen. Vier Wildschweinindividuen wiesen den heterozygoten Genotyp auf, fünf waren homozygot für das A-Allel. Darüber hinaus wurde bei fünf Hausschweinen, darunter drei Krškopolje-Individuen aus Slowenien, sowohl das A- als auch das G-Allel gefunden. So konnten wir durch HRM-Genotypisierung überprüfen, ob die mit assayChr9W und assayChr9D erzielten Ergebnisse mit den jeweiligen Genotypen der Individuen übereinstimmen. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass die beiden Singleplex-Assays für den SNP rs81416363, assayChr9W und assayChr9D, keine eindeutige Unterscheidung zwischen Wildschwein und Hausschwein ermöglichen.

Normalisierte HRM-Kurven für (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) auf Chromosom 9 für homozygote G (Wildschwein), homozygote A (Hausschwein) und heterozygote A + G und (B) SNP g.299084751 C > T auf Chromosom 1 für homozygot C (Wildschwein), homozygot T (Hausschwein) und heterozygot C + T.

Mit assayChr1D wurden alle Hausschweinproben bis auf drei als Hausschwein klassifiziert (Abb. 6). In Übereinstimmung mit assayChr9D waren die Ct-Werte, die für magere und subkutane Rückenfettproben der 12 Cinta Senese-Individuen erhalten wurden, sehr ähnlich (mittlerer Ct ± SD von 25,99 ± 0,25 (n = 48) bzw. 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Mit dem AssayChr1D wurden jedoch auch fünf der 30 Wildschweinproben als Hausschwein identifiziert. Die Analyse von Wildschweinproben mit assayChr1W führte nur zu einem negativen Ergebnis. Allerdings führten auch eine Mangalica-Probe und sechs Turopolje-Individuen zu einer Erhöhung des Fluoreszenzsignals mit assayChr1W.

In der Studie von Fontanesi et al.10 hatte der SNP g.299084751 C > T genotypisiert, indem Proben von 293 Hausschweinen von fünf kommerziellen Rassen (Italian Large White, Italian Landrace, Italian Duroc, Belgian Landrace und Piétrain) und 201 Wildschweinen aus Südmitteleuropa (Norditalien) und Südosteuropa (Slowenien und westliche Balkanregionen) analysiert wurden. Fontanesi et al. stellten fest, dass alle Hausschwein-Individuen homozygot für das T-Allel waren. 7,5 % der Wildschweinindividuen trugen mindestens eine Kopie des T-Allels, wobei Individuen aus Südosteuropa häufiger (12,2 %) als Individuen aus Südmitteleuropa (3,6 %) vorkamen. 11,1 % der Wildschweine aus Südosteuropa wiesen den heterozygoten C/T-Genotyp auf.

Bei der Genotypisierung der Wildschwein- und Hausschweinindividuen für den SNP g.299084751 C > T mittels HRM-Analyse konnten wir das T-Allel nicht nur bei Hausschweinen, sondern auch bei einigen Wildschweinen nachweisen (Abb. 7B). Das Wildschweinindividuum aus den USA zeigte den homozygoten T-Genotyp, während das Wildschweinindividuum aus Niederösterreich sowohl das C- als auch das T-Allel trug. Die Mehrheit der Wildschweinindividuen war jedoch homozygot für das C-Allel. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Anstieg des Fluoreszenzsignals bei drei Wildschweinproben (Deutschland, Bad Kissingen und Perleberg, sowie Europa), der mit dem AssayChr1D erzielt wurde, nicht mit ihrem Genotyp übereinstimmt und daher durch Kreuzreaktivität verursacht wurde. Bei der Mehrheit der Hausschwein-Individuen wurde festgestellt, dass sie homozygot für das T-Allel sind. Bei sechs von acht Turopolje-Individuen wurde jedoch der heterozygote C/T-Genotyp festgestellt, was erklärt, warum sowohl mit assayChr1D als auch mit assayChr1W eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals erzielt wurde. Die hohe Häufigkeit des heterozygoten C/T-Genotyps bei Turopolje, einer Hausschweinrasse aus Kroatien, steht im Einklang mit einer sehr aktuellen Arbeit der Forschungsgruppe von Fontanesi. Bei der Genotypisierung von 47 Turopolje-Individuen wurde die Häufigkeit des T- und des C-Allels mit 0,57 bzw. 0,43 angegeben19.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass weder die beiden Singleplex-Assays, die auf den SNP rs81416363 abzielen, noch der Duplex-Assay, der auf den SNP g.299084751 C > T abzielt, allein eine eindeutige Unterscheidung zwischen Wildschwein und Hausschwein ermöglichen. Berücksichtigt man jedoch die Ergebnisse der beiden Singleplex-Assays und des Duplex-Assays, kann die Unterscheidungskraft drastisch erhöht werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass, wenn die beiden Assays für dieselbe Unterart (z. B. assayChr9D und assayChr1D) zu einer identischen Klassifizierung führen (im gegebenen Beispiel Hausschwein) und die mit den beiden Assays für die andere Unterart erzielten Ergebnisse (im gegebenen Beispiel assayChr9W und assayChr1W) mehrdeutig sind, die Wahrscheinlichkeit einer Fehlklassifizierung gering ist, wenn man sich auf die identischen Ergebnisse verlässt. Mit dieser Strategie konnten 86 (91,5%) von 94 Individuen korrekt zugeordnet werden.