Translation ist ein Prozess, der die Synthese einer Aminosäurekette aus einem mRNA-Bauplan beinhaltet. Diese Polypeptidketten falten sich zu funktionellen Proteinen. Die Translation findet außerhalb des Zellkerns statt, sobald die Kernprozessierung der prä-mRNA abgeschlossen ist und die mRNA-Moleküle über die Kernporen in das Zytoplasma transportiert wurden. Die Translation wird in erster Linie durch Ribosomen erleichtert, die sich am rauen endoplasmatischen Retikulum, an der äußeren Oberfläche der Kernhülle oder im Zytoplasma befinden.
- Initiierung
- Verlängerung
- Beendigung
- Wiederverwertung
Eine Reihe von molekularen Komponenten spielen eine Rolle bei der Translation, wobei das Ribosom die wichtigste ist. Dieser makromolekulare Komplex setzt sich aus mehreren Proteinen und rRNA-Molekülen zusammen. Alle Ribosomen verfügen über eine kleine und eine große Untereinheit, deren Zusammensetzung jedoch von Spezies zu Spezies sehr unterschiedlich ist. Beim Menschen beispielsweise besteht die kleine 40S-Untereinheit aus 33 Proteinen und einem einzigen 18S-rRNA-Molekül, während die große 60S-Untereinheit aus 47 Proteinen und drei rRNAs (5S, 5.8S und 28S) besteht.
Trotz der Identifizierung von 80 Proteinen, die mit dem menschlichen Ribosom assoziiert sind, werden nur 34 in anderen Eukaryoten oder Prokaryoten gefunden. Während für die Ribosom-assoziierten Proteine allgemeine Funktionen vorgeschlagen wurden, wie die Stabilisierung des Komplexes und die Regulierung der Translation, wurden einige auch der co-translationalen Modifikation von neu synthetisierten Proteinen zugeschrieben (nachzulesen in ).
Elongation
Im Gegensatz zu den Initiations-, Terminations- und Ribosomen-Recycling-Phasen der Translation sind die Mechanismen, die die Elongation vorantreiben, zwischen Eukaryonten und Bakterien sehr konserviert (nachzulesen in ).
Codon-Erkennung
Die Elongation erfolgt in mehreren wohldefinierten Schritten, beginnend mit der Erkennung der mRNA-Codons durch die entsprechende Aminoacyl-tRNA. Die Assoziation mit der mRNA erfolgt über die ribosomale A-Stelle und wird von verschiedenen Elongationsfaktoren beeinflusst. Beispielsweise liefert die GTPase eEF1A Aminoacyl-tRNAs an die A-Stelle, nachdem sie von eEF1B, einem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF), der die Dissoziation von GDP von eEF1A beschleunigt, aktiviert wurde.
Peptidbindungsbildung
Nach der Erkennung des mRNA-Codons wird eine Peptidbindung zwischen der Aminoacyl-tRNA und der Peptidyl-tRNA (die sich in der ribosomalen P-Stelle befindet) hergestellt. Diese Reaktion wird durch die Peptidyltransferase erleichtert, die selbst kein Protein, sondern eine hochkonservierte ribosomale RNA ist. Der Mechanismus der Peptidbindungsbildung beinhaltet eher Konformationsänderungen an der aktiven Stelle als eine chemische Katalyse durch ribosomale Gruppen und wird durch eine günstige Entropieänderung angetrieben .
Translokation der mRNA und tRNAs durch das Ribosom
Nach der Bildung der Peptidbindung wird die A-Stelle frei, wenn die sie besetzende Peptidyl-tRNA in die P-Stelle der großen ribosomalen Untereinheit wandert und gleichzeitig eine vorhandene deacylierte tRNA ersetzt, die sich zur E-Stelle bewegt, bevor sie das Ribosom verlässt. Wenn die Aminosäurekette wächst und die A- und P-Stellen vorübergehend von neuen Aminoacyl- bzw. Peptidyl-tRNAs besetzt werden, findet eine Translokation der mRNA durch das Ribosom statt.
Zwei Mechanismen, die durch Konformationsänderungen in den ribosomalen Untereinheiten gekennzeichnet sind, erleichtern die mRNA- und tRNA-Translokation. Diese sind als „ratcheting“ und „swiveling“ bekannt.
Ratcheting wird in allen Stadien der Translation beobachtet, wobei die kleine ribosomale Untereinheit eine leichte Drehung von etwa 8° gegenüber der großen Untereinheit erfährt (siehe ). Dies unterscheidet sich von der Drehung, die eine Bewegung der Kopfdomäne (30S) der kleinen Untereinheit beinhaltet. Das Schwenken spielt eine wichtige Rolle bei der intrinsischen Helikaseaktivität des Ribosoms, die für das Abwickeln sekundärer mRNA-Strukturen wichtig ist.
Diese Mechanismen sorgen letztlich dafür, dass sich die tRNA sequenziell (von der A-Site zur P-Site zur E-Site) bewegt, und ermöglichen die Bildung von Zwischenzuständen, die bekanntermaßen während der mRNA-tRNA-Translokation auftreten. Diese Zustände, die auch als Hybridzustände bezeichnet werden, lassen sich am Beispiel des eukaryotischen Modells beschreiben. Hier bewegen sich die 3′-Enden der tRNA, die die A- und P-Stellen besetzen, um die P- und E-Stellen in der 60S-Untereinheit zu besetzen, während die 5′-Enden, die mit der mRNA assoziiert sind, an den A- bzw. P-Stellen der 40S-Untereinheit verankert bleiben.
Diese Hybridzustände werden vorübergehend durch die Bindung von eEF2-GTP (EF-G-GTP in Prokaryonten) an die ribosomale A-Stelle stabilisiert. Die Hydrolyse des GTP, die durch die GTPase-Aktivität des EF-G oder des eukaryotischen Homologen eEF2 vermittelt wird, ermöglicht es jedoch, den Ratschenmechanismus fortzusetzen, und bewirkt, dass sich die mRNA und die 5′-Enden der tRNA von der A- und P-Stelle in die P- bzw. E-Stelle bewegen. Sobald die kanonische A/A, P/P, E/E (60S/40S) Konformation wiederhergestellt ist, dissoziiert das EF-G-GDP vom Ribosom und lässt die A-Stelle offen, um ein neues Aminoacyl-tRNA-Molekül aufzunehmen.
Die GTP-Hydrolyse durch EF-G / eEF2 und die anschließende Drehung der Kopfdomäne unterstützen die tRNA-Translokation zusätzlich, indem sie eine spontane Rückwärtsbewegung der tRNA verhindern.
Initiierung der Translation
Der erste Schritt der Translation wird als Initiierung bezeichnet. Hier werden die großen (60S) und kleinen (40S) ribosomalen Einheiten zu einem voll funktionsfähigen 80S-Ribosom zusammengesetzt. Dieses wird am Startcodon (AUG) des zu übersetzenden mRNA-Strangs positioniert (Übersicht in ).
Die Initiation gilt als der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt im Gesamtprozess und wird in erster Linie durch eine Gruppe von Proteinen reguliert und koordiniert, die als eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs) bekannt sind. Diese Faktoren variieren in Größe und Komplexität; von der einzelnen 113kDa-Untereinheit eIF1 bis zum 700kDa-Komplex eIF3. Beim Menschen wirken mindestens 12 eIFs zusammen, um die Initiation zu regulieren, wobei jeder von ihnen eine bestimmte Rolle spielt, die in ausführlich beschrieben wurde.
Die Initiation beginnt mit der Bildung eines ternären Komplexes, der eIF2, GTP und die Initiator-tRNA (Met-tRNAi) umfasst. Die Hauptaufgabe des ternären Komplexes besteht darin, den Initiator an die 40S-Untereinheit zu liefern, die anschließend einen 43S-Komplex bildet, der auch als PIC (Pre-Initiation Complex) bezeichnet wird. Mit Hilfe von eIF4G und eIF3 bindet sich der PIC am oder in der Nähe des 5′-Terminus der mRNA. Dieser ist durch eine 7-Methylguanosin-Kappe (m7-G-Kappe) gekennzeichnet. Nach der Bindung durchsucht das PIC die 5′-untranslatierte Region, um das Initiationscodon zu lokalisieren.
Die Leader-Sequenz des 5′-Terminus wird durch die Helikase-Aktivität mehrerer eIFs (einschließlich eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3) in einem abgewickelten Zustand gehalten. Sobald die 40S-Untereinheit am Initiationscodon positioniert ist, wird die 60S-Untereinheit rekrutiert, um ein elongationskompetentes 80S-Ribosom zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt ist das mRNA-Startcodon an der ribosomalen P-Stelle lokalisiert, und der gesamte Initiationskomplex ist bereit, in die Elongationsphase einzutreten.
Es ist wichtig zu wissen, dass die 40S-Untereinheit unabhängig von der m7-G-Kappe an die mRNA binden kann. Das bekannteste Beispiel hierfür, das in 5-10 % der zellulären mRNAs vorkommt, ist die Bindung der 40S-Untereinheit an eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES). Weitere m7-G-Cap-unabhängige Initiationswege sind Shunting, Tethering, Translationsverstärker, ein TISU-Element und ein Polyadenylat-Leader im 5′-Terminus.
Ribosomen-Recycling
Der letzte Schritt der Translation ist das Ribosomen-Recycling, bei dem sich das Ribosom in seine kleineren Untereinheiten aufspaltet und für eine weitere Translationsrunde vorbereitet. Bei Eukaryoten bedeutet dies, dass sich das 80S-Ribosom in seine 40S- und 60S-Untereinheiten aufspaltet. Obwohl dieser Schritt den Abschluss des Übersetzungsprozesses markiert, kann er auch aus einer Vielzahl anderer Gründe erfolgen, z. B. wenn die Synthese der Polypeptidkette fehlschlägt, wenn beschädigte mRNA angetroffen wird oder nach dem Zusammenbau von leeren Ribosomen. Darüber hinaus wird dieser Schritt häufig als Beginn der Initiation beschrieben, wobei das Schlüsselprotein, das die Ribosomenspaltung erleichtert, auch mit mehreren Initiationsfaktoren assoziiert ist (ABCE1 hat sich in Hefemodellen als assoziiert mit eIF2, eIF3 und eIF5 erwiesen).
In Eukaryonten wird das Ribosomen-Recycling in erster Linie durch ABCE1 (Rli1 in Hefe) erleichtert, das zur ABC-Superfamilie der ATPasen gehört. Dieses Protein, das zwei Nukleotid-Bindungsdomänen und eine einzigartige FeS1-Cluster-Domäne besitzt, bindet an den Post-Termination-Komplex, sobald sich das RF3-GDP vom Ribosom gelöst hat. Diese Verbindung entsteht durch die Interaktion zwischen dem FeS-Cluster und eRF1. Wichtig ist, dass ACBE1 auch zahlreiche Bindungsstellen enthält, die Wechselwirkungen zwischen ribosomalen Untereinheiten und verschiedenen ribosomalen Proteinen ermöglichen. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass ein HLH-Motiv in der ersten Nukleotidbindungsdomäne sowohl an die 18S rRNA als auch an rpS24-A bindet. Obwohl der genaue Mechanismus, der die ribosomale Aufspaltung antreibt, unklar bleibt, wird vorgeschlagen, dass sie in Eukaryoten das Ergebnis einer Konformationsänderung in ABCE1 ist, die durch ATP-Hydrolyse induziert wird.
Wie bereits erwähnt, ist die Peptidfreisetzung keine Voraussetzung für die Dissoziation der ribosomalen Untereinheiten oder für die Bindung von ABCE1. Dies ist wichtig, wenn das Ribosomen-Recycling als Reaktion auf eine mRNA-Schädigung oder den Aufbau freier Ribosomen induziert wird, da kein Stopp-Codon erkannt wird, um die Terminierung und Peptidfreisetzung einzuleiten. Um dieses Problem zu überwinden, kann ABCE1 die Peptidfreisetzung in ähnlicher Weise wie der ternäre eRF1-eRF3-GTP-Komplex erleichtern, und es wurde gezeigt, dass dies unabhängig von der ATP-Hydrolyse geschieht. Hier induziert die ATP-Hydrolyse eine Konformationsänderung in eRF1, die die Peptidyl-tRNA-Hydrolyse fördert.
Wichtig ist, dass eRF1 und eRF3 ausreichen können, um die Dissoziation der Untereinheiten einzuleiten; dies geschieht jedoch mit einer langsameren Geschwindigkeit.
Die Mechanismen des Recyclings in Prokaryonten unterscheiden sich von denen in Eukaryonten, wobei der Hauptunterschied im Vorhandensein eines speziellen Ribosomen-Recycling-Faktors (RRF) besteht, der zusammen mit EF-G wirkt, um die ribosomalen Untereinheiten in Bakterien zu trennen.
Beendigung der Translation
Der nächste Schritt im Prozess der Translation ist die Beendigung. In diesem Schritt zeigt ein mRNA-Stopcodon an, dass keine weiteren Aminosäuren an das wachsende Protein angefügt werden sollen. Die Terminierung wird in Eukaryonten durch nur zwei Faktoren (eRF1 und eRF3) erleichtert und unterscheidet sich erheblich von dem Prozess in Prokaryonten, an dem drei Faktoren (RF1, RF2 und RF3) beteiligt sind. In Eukaryonten müssen zwei verschiedene Prozesse ablaufen, damit die Peptidelongation erfolgreich beendet werden kann: die Peptidfreisetzung und die Bildung des Postterminationskomplexes. In einigen Fällen, in denen die Translation vor der Erkennung eines Stoppcodons enden muss, kann der Terminierungsschritt übersprungen und das Ribosomenrecycling frühzeitig eingeleitet werden. In diesem Fall wird die Peptidfreisetzung durch ABCE1 erleichtert.
Die Terminierung wird durch den Eintritt eines Stoppcodons (UAA, UGA oder UAG) in die ribosomale A-site ausgelöst. Dieses Codon wird von einem Freisetzungsfaktor der Klasse 1 (RF1) erkannt. In Eukaryonten bindet dieser Faktor (eRF1) an das Ribosom als Teil eines vormontierten ternären Komplexes, der aus eRF1, eRF3 und GTP besteht. Das Stop-Codon wird durch ein konserviertes Motiv am aminoterminalen Ende des Proteins, wie das NIKS-Motiv, erkannt.
eRF1 ist auch an der Peptidyl-tRNA-Hydrolyse und der Peptidfreisetzung aus dem Peptidyltransferasezentrum (PTC) beteiligt. Dies geschieht infolge der GTP-Hydrolyse durch eRF3, die eine Konformationsänderung in eRF1 hervorruft, die es seinem Gly-Gly-Gln (GGQ)-Motiv, das sich in der „mittleren“ (M) Domäne befindet, ermöglicht, in das ribosomale PTC einzudringen und die Peptidyl-tRNA-Hydrolyse zu erleichtern. Dieser Mechanismus unterscheidet sich von dem in Prokaryonten, wo die Peptidfreisetzung für die GTP-Hydrolyse durch RF3 erforderlich ist und dieser somit vorausgeht.
Nach der GTP-Hydrolyse und der Peptidfreisetzung dissoziiert das RF3-GDP vom Protein und lässt RF1 zurück, das im so genannten Post-Termination-Komplex an das Ribosom gebunden bleibt. Dies bereitet das Ribosom im Wesentlichen auf das ribosomale Recycling vor.