Diferenciación entre jabalí y cerdo doméstico en la alimentación mediante la focalización de dos loci génicos por PCR en tiempo real

Diseño de cebadores y sondas

Para el diseño de cebadores y sondas, seleccionamos polimorfismos de los que ya se había informado que permitían la discriminación de jabalí y cerdo doméstico. Comenzamos con el SNP g.299084751 C > T en el gen NR6A1, que se ha encontrado asociado con el número de vértebras torácicas y lumbares: los jabalíes, que son homocigotos para el alelo de tipo salvaje g.299084751 C, tienen 19 vértebras, mientras que los cerdos domésticos, que son homocigotos para g.299084751 T, tienen 21-23 vértebras. En el estudio de Fontanesi et al., este SNP se utilizó para discriminar el jabalí y el cerdo doméstico mediante PCR-RFLP10. Nuestro objetivo era diseñar un par de cebadores para la amplificación de la región objetivo tanto en jabalí como en cerdo doméstico, y dos sondas TaqMan, específicas para el alelo de jabalí (g.299084751 C) y el alelo de cerdo doméstico (g.299084751 T), respectivamente. El ensayo dúplex debería permitir detectar simultáneamente el jabalí y el cerdo doméstico en un mismo pozo. En total, diseñamos cuatro cebadores directos, tres cebadores inversos, cuatro sondas para jabalíes y una sonda para cerdos domésticos y los combinamos en 21 sistemas de cebadores/sondas (Chr1a – u, Tabla Suplementaria 1). El sistema de cebadores/sondas Chr1a se dirigió a la cadena superior y los sistemas de cebadores/sondas Chr1b-u a la cadena inferior del gen NR6A1. En una serie de experimentos, investigamos si los sistemas de cebadores/sondas eran específicos para el jabalí o mostraban una reactividad cruzada con las razas de cerdos domésticos/cruzados. El sistema de cebadores/sondas Chr1a dio lugar a un valor ΔCt ≥ 10,56 entre el cerdo doméstico y el jabalí (Tabla suplementaria 2). Para los sistemas de cebadores/sondas Chr1i – o, los valores ΔCt oscilaron entre 8,65 y 11,19. Los sistemas de cebadores/sondas Chr1b – h y Chr1p – t no dieron lugar a un aumento de la señal de fluorescencia para las razas/cruces de cerdos domésticos. Dado que el sistema de cebadores/sondas Chr1q dio lugar al valor Ct más bajo (24,77; n = 2) para el jabalí, probamos su aplicabilidad en combinación con una sonda TaqMan para el cerdo doméstico en el formato de ensayo dúplex (sistema de cebadores/sondas Chr1u, Tabla Suplementaria 1). Dado que los valores Ct tanto para el jabalí (26,21, n = 2) como para el cerdo doméstico (27,90, n = 2) fueron satisfactorios, todos los experimentos posteriores de PCR dirigidos al SNP g.299084751 C > T se realizaron con el sistema de cebador/sonda Chr1u. En lo sucesivo, el ensayo de PCR dúplex en tiempo real se denomina assayChr1, que consiste en el ensayo para el cerdo doméstico, assayChr1D, que incluye el cebador delantero Chr1f4, el cebador inverso Chr1r2 y la sonda Chr1p1D, y el ensayo para el jabalí, assayChr1W, que incluye el cebador delantero Chr1f4, el cebador inverso Chr1r2 y la sonda Chr1p4W (Fig. 1A).

Secuencias parciales de (A) el gen NR6A1 en el cromosoma 1 que lleva el SNP g.299084751 C > T, que es el objetivo del ensayo dúplex «assayChr1», y (B) el cromosoma 9 que lleva el SNP g.118314929 A > G (rs81416363), que es el objetivo de los dos ensayos singleplex «assayChr9D» y «assayChr9W». Las flechas indican las posiciones de los cebadores (gris oscuro) y las sondas (gris claro). (A) El ensayo dúplexChr1 incluía el cebador directo Chr1f4, el cebador inverso Chr1r2, la sonda Chr1p4W y la sonda Chr1p1D. (B) El ensayo singleplexChr9D incluye el cebador directo Chr9f8, el cebador inverso Chr9r17D y la sonda Chr9p2; el ensayo singleplexChr9W incluye el cebador directo Chr9f8, el cebador inverso Chr9r12W y la sonda Chr9p2. Las bases específicas de la subespecie se muestran en negrita (flechas rojas verticales) y las bases erróneas en azul (flechas azules verticales).

Como habíamos aprendido de la literatura que el poder de discriminación al dirigirse a un solo polimorfismo probablemente no es suficiente, buscamos otro locus genético adecuado. Al investigar 20 SNPs para su aplicabilidad para diferenciar entre jabalí y cerdo doméstico, Beugin et al. habían encontrado que los SNPs rs80864596 (intergénico, cromosoma 5), rs80796712 (glucógeno sintasa quinasa 3-beta, cromosoma 13) y rs81416363 (intergénico, cromosoma 9) mostraban el mayor poder de discriminación11. Por lo tanto, seleccionamos estos tres SNP para diseñar sistemas de cebadores/sondas. En comparación con el diseño de cebadores/sondas para el SNP g.299084751 C > T, seguimos una estrategia diferente. En lugar de ubicar la base específica de la subespecie en la sonda, la ubicamos en el penúltimo sitio desde el extremo 5′ del cebador directo o inverso. Para aumentar la especificidad, introdujimos desajustes de base deliberados. Esta técnica denominada ensayo de mutación por amplificación de desajustes (MAMA)12,13 tiene la ventaja de que es bastante rentable, ya que una misma sonda puede probarse con varios cebadores que difieren en la posición del desajuste. En la primera serie de experimentos introdujimos la base de desajuste en la tercera o sexta posición del extremo 3′ del cebador que llevaba la base específica de la subespecie. Cuando desarrollamos los ensayos de PCR en tiempo real para el ciervo rojo, el gamo y el ciervo sika, respectivamente14,15,16, esta estrategia resultó ser exitosa. Sin embargo, en el presente estudio ninguno de los sistemas de cebadores/sondas (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Tabla Suplementaria 1) permitió la diferenciación entre cerdo doméstico y jabalí (Tabla Suplementaria 3). Los mejores resultados (valor ΔCt entre las razas/cruces de cerdos domésticos y jabalíes ≥5,24) se obtuvieron con el sistema de cebadores/sondas Chr9j. En este sistema de cebador/sonda, dirigido al SNP rs81416363 del cromosoma 9, la base de desajuste se localizó en la 3ª posición del extremo 3′ del cebador (TTCACG → TTCCCG). Para aumentar la especificidad, introdujimos otro desajuste en la 4ª (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) o 5ª posición (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) desde el extremo 3′ del cebador. La introducción de desajustes adicionales resultó ser un éxito. Con el sistema de cebadores/sonda Chr9r (Tabla suplementaria 1) obtuvimos tanto el valor Ct más bajo para el jabalí (22,09; n = 2) como el valor ΔCt más alto (10,52) entre las razas/cruces de cerdos domésticos y el jabalí (Tabla suplementaria 3). Este ensayo de PCR en tiempo real para jabalíes, dirigido al SNP rs81416363 localizado en el cromosoma 9, se basó en el sistema de cebadores/sondas Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

A continuación, aplicamos la estrategia MAMA para desarrollar el correspondiente ensayo de PCR en tiempo real, dirigido al SNP rs81416363 localizado en el cromosoma 9, para cerdos domésticos. Localizamos la base específica del cerdo doméstico en la penúltima base del extremo 5′ del cebador y la base errónea en la tercera posición del extremo 3′ (sistemas de cebador/sonda Chr9v – x; Tabla suplementaria 1). Sin embargo, la introducción de una base de desajuste no fue suficiente para permitir la diferenciación del cerdo doméstico y el jabalí. La introducción de bases desajustadas en la 3ª y 5ª posición del extremo 3′ del cebador (sistemas de cebadores/sondas Chr9y – ag) condujo a un valor de ΔCt ≥ 4,83. Cuando los desajustes se encontraban en las posiciones 3 y 4 (sistemas de cebadores/sondas Chr9ah – aj), el valor de ΔCt era ≥5,85. Introduciendo tres bases de desajuste consecutivas junto a la base específica de la subespecie (sistemas de cebadores/sondas Chr9ak – am), se pudo aumentar la especificidad. El sistema de cebador/sonda Chr9ak, en el que los desajustes se encontraban en la posición 3, 4 y 5 (TTCATG → TGGTTG) condujo al valor ΔCt más alto de ≥9,97. Así, todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo con el sistema de cebadores/sondas Chr9ak. En lo sucesivo, los dos ensayos singleplex dirigidos al SNP rs81416363 en el cromosoma 9 se denominan assayChr9D, que incluye el cebador delantero Chr9f8, el cebador inverso Chr9r17D y la sonda Chr9p2, y assayChr9W, que incluye el cebador delantero Chr9f8, el cebador inverso Chr9r12W y la sonda Chr9p2 (Fig. 1B).

Optimización de la concentración y la relación cebador/sonda

Todos los resultados presentados anteriormente se obtuvieron con concentraciones de cebador y sonda de 500 nM y 200 nM (sistemas cebador/sonda dirigidos al cromosoma 1), y 200 nM y 100 nM (sistemas cebador/sonda dirigidos a los cromosomas 5, 9 y 13), respectivamente. A continuación, se investigó si la especificidad de los ensayos de PCR en tiempo real podía aumentarse optimizando la concentración y la relación cebador/sonda. En el caso del ensayoChr1, las concentraciones óptimas de cebador y sonda resultaron ser de 1.000 nM y 200 nM, respectivamente (Tabla Suplementaria 4). En el caso de assayChr9W y assayChr9D, un excedente del cebador que lleva tanto la base específica de la subespecie como las bases de desajuste dio lugar a valores de ΔCt más altos entre la subespecie de reacción cruzada y la especie objetivo. La selectividad más alta del assayChr9W y del assayChr9D se alcanzó con concentraciones de cebador delantero/cebador inverso/sonda de 12,5/200/50 nM y 62,5/800/50 nM, respectivamente.

Pruebas de reactividad cruzada

A continuación, realizamos pruebas de reactividad cruzada con aislados de ADN de jabalíes, varias razas/cruzamientos de cerdos domésticos y otras 22 especies animales enumeradas en la Tabla Suplementaria 5. Las figuras 2A-D muestran las curvas de amplificación obtenidas con assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W y assayChr1D, respectivamente. El assayChr9W mostró una ligera reactividad cruzada con cerdos domésticos, ciervos sika, íbices alpinos, ovejas, cabras y gamuzas (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), el assayChr9D con jabalíes, ciervos sika, alces, caballos y pavos (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). A diferencia de los ensayos dirigidos al SNP rs81416363 en el cromosoma 9, assayChr1 no mostró ninguna reactividad cruzada (con la excepción de assayChr1W para el corzo en sólo una de las cuatro réplicas). También se analizaron aislados de ADN de 50 especies de plantas comúnmente utilizadas como ingredientes alimentarios (Tabla Suplementaria 6). Ninguno de los ensayos mostró reactividad cruzada con ninguna de las especies vegetales.

Resultados obtenidos al realizar ensayos de reactividad cruzada con aislados de ADN (10 ng/µL) de 22 especies animales y jabalí/cerdo doméstico. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W y (D) assayChr1D.

Control de la aplicabilidad de varias mezclas maestras comerciales

En una siguiente serie de experimentos, investigamos si el tipo de mezcla maestra comercial influía en la selectividad de los ensayos. Analizamos aislados de ADN de 23 especies animales, incluyendo 3 individuos de jabalí y 11 razas/cruces de cerdo doméstico, con un total de cinco mezclas maestras de diferentes proveedores. Las mezclas maestras y los respectivos programas de temperatura se indican en la tabla suplementaria 7. En general, el tipo de mezcla maestra influyó tanto en los valores Ct absolutos como en los valores ΔCt entre las especies objetivo y las (sub)especies con reacción cruzada. Sin embargo, los ensayos de PCR en tiempo real se vieron influenciados en diferente medida. En el caso del ensayoChr9W, por ejemplo, las mezclas 2 y 3 dieron lugar a valores de Ct más altos que las mezclas maestras 1 (la mezcla maestra estándar en el presente estudio), 4 y 5 (Ct ± SD (n = 6): mezcla 1: 25,03 ± 0,15; mezcla 2: 31,17 ± 1,70; mezcla 3: 28,43 ± 0,13; mezcla 4: 26,64 ± 0,10; mezcla 5: 26,64 ± 0,17). En el caso del ensayoChr9D, el tipo de mezcla maestra influyó en los valores de ΔCt y, por tanto, en la selectividad del ensayo. Los valores de ΔCt obtenidos con las mezclas maestras 1, 2, 3 y 4 fueron ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 y ≥ 5,86, respectivamente, mientras que con la mezcla maestra 5 no se observó ninguna reactividad cruzada. En el caso del ensayoChr1, se obtuvieron valores Ct bastante similares con las mezclas maestras 1, 3 y 4. Sin embargo, las mezclas maestras 2 y 5 no dieron lugar a la formación de ningún producto, muy probablemente porque estas mezclas no son adecuadas para el multiplexado. Basándonos en estos resultados, recomendamos encarecidamente que se compruebe la aplicabilidad si se pretende utilizar otro tipo de mezcla maestra.

Robustez

La robustez de los ensayos de PCR en tiempo real se investigó variando la temperatura de recocido ±1 °C y el volumen de la mezcla de reacción por pocillo en ±5% y aplicando dos cicladores de PCR en tiempo real diferentes. Los experimentos se realizaron con aislados de ADN de jabalí, cerdo doméstico y corzo. Para el assayChr9W y el assayChr9D, los valores Ct fueron muy similares a los obtenidos en condiciones estándar (valores ΔCt <1,00), excepto cuando se aumentó la temperatura de recocido a 61 °C (valores ΔCt ≤2,16 y ≤1,57, respectivamente). Con valores de ΔCt ≤0,77, el ensayoChr1 resultó ser aún más robusto. Ni la reducción del volumen total de reacción ni el uso de otro ciclador de PCR en tiempo real influyeron sustancialmente en los valores Ct, lo que demuestra la solidez de los ensayos de PCR en tiempo real.

Rango de trabajo, rango lineal y eficiencia de amplificación

Al analizar un aislado de ADN de jabalí (211 µg/mL) y dos aislados de ADN de cerdo doméstico (158 µg/mL y 160 µg/mL) diluidos en serie en agua (1:2-1:524,288), assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W y assayChr1D fueron lineales entre 211 µg/mL y 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL y 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL y 6 ng/mL (R2 = 0,9994) y 160 µg/mL y 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivamente (Fig. 3A). Las eficiencias de amplificación calculadas a partir de las pendientes de las curvas estándar fueron del 83%, 96%, 93% y 95%, respectivamente. Además, se evaluó el rango de linealidad analizando aislados de ADN de jabalí y cerdo doméstico diluidos en serie en ADN de esperma de arenque. En el caso del assayChr9W y del assayChr9D, la linealidad osciló entre 20 µg/mL y 20 ng/mL (R2 = 0,9988) y entre 20 µg/mL y 39 ng/mL (R2 = 0,9985), respectivamente (Fig. 3B). En el caso de assayChr1W y assayChr1D, la linealidad estuvo en el rango de 20 µg/mL a 5 ng/mL (R2 = 0,9978) y 20 µg/mL a 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivamente. Las eficiencias de amplificación calculadas a partir de las pendientes de las curvas estándar fueron del 76%, 90%, 97% y 101%, respectivamente.

Rango de linealidad de los cuatro ensayos, (A) determinado en agua como fondo y (B) determinado en ADN de esperma de arenque como ADN de fondo no objetivo.

Estos resultados indican que el rango de trabajo de los ensayos de PCR en tiempo real es casi idéntico, mientras que el rango de linealidad es más estrecho para los ensayos dirigidos al cromosoma 9 que para los dirigidos al cromosoma 1. Todas las eficiencias de amplificación se situaron entre el 90% y el 110%, tal y como recomiendan las directrices de la ENGL17 , excepto la del ensayoChr9W (83% en agua, 76% en ADN de esperma de arenque). La menor eficiencia de amplificación del assayChr9W se debe probablemente a una menor estabilidad de unión del cebador debido a los desajustes, introducidos para aumentar la selectividad para la especie animal objetivo.

Límite de detección (LOD) en el ADN de esperma de arenque y en el ADN de cerdo como ADN de fondo

El LOD se definió como la menor concentración de ADN que dio lugar a un aumento de la señal de fluorescencia en al menos 19 de 20 réplicas. Además, el valor Ct debe estar por debajo del valor Ct obtenido para las especies con reacción cruzada.

En el ADN de esperma de arenque, el LOD del ensayoChr9D (1,0%, p/p, Fig. 4A) fue ligeramente superior al LOD de los otros tres ensayos (0,2%, p/p, Fig. 4B-D). El mayor LOD del ensayoChr9D se debe a la reactividad cruzada con el jabalí (valor ΔCt entre el jabalí y el cerdo doméstico sólo ≥8,41).

Determinación del LOD analizando diluciones en serie de (A-D) mezclas de ADN que contienen ADN de jabalí o de cerdo doméstico en ADN de esperma de arenque y (E-H) una mezcla de ADN que contiene ADN de jabalí en ADN de cerdo doméstico o ADN de cerdo doméstico en ADN de jabalí como ADN de fondo. (A,E) se obtuvieron utilizando assayChr9D, (B,F) utilizando assayChr9W, (C,G) utilizando assayChr1D y (D,H) utilizando assayChr1W. Las mediciones se realizaron en 20 réplicas. Los círculos representan valores Ct individuales, las líneas horizontales indican los valores medios.

Además, determinamos el LOD de los ensayos de PCR en tiempo real para jabalí, assayChr1W y assayChr9W, en ADN de cerdo doméstico como fondo, y el de los ensayos para cerdo doméstico, assayChr1D y assayChr9D, en ADN de jabalí como fondo. Con un 2%, 0,2%, 5% y 2% (p/p), los LOD del assayChr9D (Fig. 4E), assayChr9W (Fig. 4F), assayChr1D (Fig. 4G) y assayChr1W (Fig. 4H) fueron bastante diferentes. El mayor LOD del assayChr1D en presencia de ADN de jabalí fue causado por la supresión de la señal, muy probablemente debido a la competencia de las dos sondas por la secuencia diana en el formato de ensayo dúplex. Para investigar la supresión de la señal con más detalle, se analizaron mezclas de ADN que contenían un 25% (p/p) de ADN de jabalí en ADN de cerdo doméstico o un 25% (p/p) de ADN de cerdo doméstico en ADN de jabalí, además de controles positivos (ADN de jabalí y ADN de cerdo doméstico, respectivamente).

Cuando comparamos los controles positivos con los estándares diluidos 1:4 que contenían ADN no objetivo, no encontramos diferencias en las curvas de amplificación (valores de ΔRn) para el assayChr9W y el assayChr9D (Fig. 5A,B). Sin embargo, en el caso de assayChr1W y assayChr1D, las señales de fluorescencia (valores de ΔRn) obtenidas para el control positivo fueron mayores que las obtenidas para el estándar diluido 1:4 a la misma concentración de ADN diana (Fig. 5C,D).

Curvas de amplificación (en vista semilogarítmica) obtenidas para mezclas de ADN (20 ng/µL) que contenían un 25% (p/p) de la subespecie objetivo (jabalí o cerdo doméstico) y un 75% (p/p) de la subespecie no objetivo (jabalí o cerdo doméstico) y diluciones en serie de las mismas (1:4 a 1:1.024). Como controles se utilizaron aislados de ADN (5 ng/µL) de jabalí y cerdo doméstico, respectivamente. AssayChr9W (A) y assayChr9D (B) muestran reactividad cruzada con la subespecie no objetivo. AssayChr1W (C) y assayChr1D (D) muestran una supresión de la señal en presencia de la subespecie no diana.

Repetibilidad

La repetibilidad de los ensayos de PCR en tiempo real se investigó analizando mezclas de extracto de carne que contenían un 30% (p/p) de ADN diana y un 70% (p/p) de ADN de subespecies no diana, así como diluciones seriadas del mismo, por duplicado cinco veces en cuatro días diferentes. La RSD de los valores Ct fue ≤1,0% (ensayoChr1W), ≤1,9% (ensayoChr9W), ≤2,3% (ensayoChr1D) y ≤3,5% (ensayoChr9D), lo que demuestra la alta repetibilidad de los ensayos.

Análisis de muestras de individuos de jabalí y cerdo doméstico

Los ensayos de PCR en tiempo real se aplicaron al análisis de muestras de 64 individuos de cerdo doméstico, incluyendo 14 razas y 6 cruces (Fig. 6A). Además, analizamos un total de 30 muestras de jabalíes de 5 países diferentes (Austria, Estonia, Alemania, Rumanía y Estados Unidos, Fig. 6B). En el caso de un individuo de jabalí de Europa, el origen exacto era desconocido. Cada muestra se analizó en al menos cuatro réplicas. A cada placa de PCR se añadió un control positivo (mezcla de ADN, 10 ng/µL) que contenía la subespecie objetivo en la misma concentración que el LOD, proporcionando el valor Ct de corte.

Resultados obtenidos para (A) 64 muestras de cerdo doméstico y (B) 30 de jabalí. Las mediciones se realizaron en al menos cuatro réplicas.

Cuando analizamos los controles positivos en 14 réplicas, la media ± SD de los valores Ct fue de 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) y 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). A excepción del ensayoChr9D, todas las muestras que dieron lugar a valores Ct más altos se consideraron <LOD. En el caso del assayChr9D, para varias muestras de jabalí se obtuvieron valores Ct ≥ 34,61. Para disminuir la probabilidad de resultados falsos positivos, fijamos el valor Ct de corte del assayChr9D en 34,00. Para la aplicación de assayChr9W y assayChr9D en los análisis de rutina, recomendamos utilizar un control positivo compuesto por un 2% (p/p) de ADN de cerdo doméstico, un 0,2% (p/p) de ADN de jabalí y un 97,8% (p/p) de ADN de esperma de arenque.

Para el análisis de muestras de cerdo doméstico con assayChr9D, obtuvimos 63 resultados positivos y sólo uno negativo (Mangalica 1) (Fig. 6). De los 12 individuos de Cinta Senese, analizamos dos partes de carne diferentes, una muestra de magro (de longissimus dorsi) y una muestra de grasa dorsal subcutánea (de lomo) (datos no mostrados). Los valores de Ct obtenidos para las muestras magras (media de Ct ± SD de 25,24 ± 0,44, n = 48) fueron muy similares a los de las muestras de grasa dorsal subcutánea (26,29 ± 0,35, n = 48). Cuando analizamos las 30 muestras de jabalí con el assayChr9D, 21 no dieron lugar a un aumento de la señal de fluorescencia, pero nueve individuos (uno de Austria, cinco de Alemania y tres de EE.UU.) fueron identificados como cerdo doméstico.

Con el assayChr9W, la mayoría de las muestras de jabalí fueron asignadas correctamente, sólo para tres muestras (una de Alemania y dos de EE.UU.) obtuvimos resultados negativos. Sin embargo, el assayChr9W también dio resultados positivos para algunos individuos de cerdos domésticos, incluyendo un Bentheim Black Pied, tres Krškopolje y tres cerdos Mangalica. En particular, los tres cerdos Mangalica de Austria fueron identificados como cerdos domésticos, mientras que los tres individuos de Alemania fueron identificados como jabalíes. En el caso del ensayoChr9, incluyendo el ensayoChr9W y el ensayoChr9D, 12 de las 94 muestras de carne dieron resultados ambiguos, porque se obtuvo un aumento de la señal de fluorescencia con ambos ensayos de PCR en tiempo real. Además, un individuo de cerdo Mangalica fue identificado como jabalí y tres individuos de jabalí como cerdo doméstico.

En el estudio de Beugin et al.11 se había probado la idoneidad del SNP rs81416363 en jabalíes «puros» cazados en un parque natural de los Vosgos en Francia y en un número limitado de razas comerciales de cerdo (Landrace, Large White, Piétrain y Duroc). Se encontró que los jabalíes son portadores del alelo G (frecuencia del 100%, sin heterocigosidad), y los cerdos domésticos del alelo A (frecuencia del 98%, heterocigosidad del 5%).

Para averiguar por qué el assayChr9W y el assayChr9D condujeron a varias clasificaciones erróneas y a algunos resultados ambiguos, genotipificamos las respectivas muestras de jabalíes y cerdos domésticos mediante análisis de fusión de alta resolución (HRM). Aplicamos el análisis HRM porque es una técnica poderosa, eficiente en tiempo y coste para el genotipado de SNP18. Las curvas de fusión normalizadas (Fig. 7A) indican que el genotipo G homocigoto no sólo se encontró en las muestras de jabalí, sino también en la muestra de Mangalica (muestra 1) para la que se obtuvo un aumento de la señal de fluorescencia con el ensayoChr9W pero no con el ensayoChr9D. Las muestras de jabalí que dieron lugar a un aumento de la señal de fluorescencia con el ensayoChr9D resultaron ser portadoras de al menos una copia del alelo A. Cuatro individuos de jabalí mostraron el genotipo heterocigoto, cinco eran homocigotos para el alelo A. Además, se encontró que cinco individuos de cerdo doméstico, incluyendo tres individuos de Krškopolje de Eslovenia, eran portadores tanto del alelo A como del G. Así, mediante el genotipado HRM pudimos verificar que los resultados obtenidos con assayChr9W y assayChr9D estaban de acuerdo con los respectivos genotipos de los individuos. Sin embargo, nuestros resultados indican que los dos ensayos singleplex dirigidos al SNP rs81416363, assayChr9W y assayChr9D, no permiten la discriminación inequívoca de jabalí y cerdo doméstico.

Curvas de HRM normalizadas para (A) el SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) en el cromosoma 9 para el homocigoto G (jabalí), el homocigoto A (cerdo doméstico) y el heterocigoto A + G y (B) el SNP g.299084751 C > T en el cromosoma 1 para el homocigoto C (jabalí), el homocigoto T (cerdo doméstico) y el heterocigoto C + T.

Con el assayChr1D, todas las muestras de cerdo doméstico excepto tres se clasificaron como cerdo doméstico (Fig. 6). De acuerdo con el assayChr9D, los valores de Ct obtenidos para las muestras de grasa dorsal magra y subcutánea de los 12 individuos de Cinta Senese fueron muy similares (Ct medio ± SD de 25,99 ± 0,25 (n = 48) y 26,36 ± 0,25 (n = 48), respectivamente). Sin embargo, con el ensayoChr1D también cinco de las 30 muestras de jabalí fueron identificadas como cerdo doméstico. El análisis de las muestras de jabalí con el assayChr1W sólo dio un resultado negativo. Sin embargo, también una muestra de Mangalica y seis individuos de Turopolje condujeron a un aumento de la señal de fluorescencia con assayChr1W.

En el estudio de Fontanesi et al.10 el SNP g.299084751 C > T había sido genotipado analizando muestras de 293 cerdos domésticos de cinco razas comerciales (Large White italiano, Landrace italiano, Duroc italiano, Landrace belga y Piétrain) y 201 jabalíes del sur de Europa central (norte de Italia) y del sureste de Europa (Eslovenia y regiones de los Balcanes occidentales). Fontanesi et al. encontraron que todos los individuos de cerdos domésticos eran homocigotos para el alelo T. El 7,5% de los individuos de jabalí eran portadores de al menos una copia del alelo T, siendo los individuos del sureste de Europa más frecuentes (12,2%) que los del centro-sur de Europa (3,6%). El 11,1% de los jabalíes del sureste de Europa eran del genotipo heterocigoto C/T.

Cuando genotipificamos los individuos de jabalí y cerdo doméstico para el SNP g.299084751 C > T mediante el análisis HRM, también detectamos el alelo T no sólo en los cerdos domésticos sino también en algunos jabalíes (Fig. 7B). El individuo de jabalí de EE.UU. mostró el genotipo T homocigoto mientras que el individuo de jabalí de la Baja Austria portaba tanto el alelo C como el T. Sin embargo, la mayoría de los individuos de jabalí eran homocigotos para el alelo C. Este resultado indica que el aumento de la señal de fluorescencia para tres muestras de jabalí (Alemania Bad Kissingen y Perleberg, y Europa) obtenido con el ensayoChr1D no estaba de acuerdo con su genotipo y, por lo tanto, era causado por la reactividad cruzada. La mayoría de los individuos de cerdo doméstico resultó ser homocigota para el alelo T. Sin embargo, seis de los ocho individuos Turopolje mostraron el genotipo heterocigoto C/T, lo que explica por qué se obtuvo un aumento de la señal de fluorescencia tanto con el ensayoChr1D como con el ensayoChr1W. La alta frecuencia del genotipo heterocigoto C/T en Turopolje, una raza de cerdos domésticos de Croacia, está de acuerdo con un trabajo muy reciente del grupo de investigación de Fontanesi. Mediante el genotipado de 47 individuos de Turopolje, la frecuencia del alelo T y del alelo C fue de 0,57 y 0,43, respectivamente19.

Nuestros resultados demuestran que ni los dos ensayos singleplex dirigidos al SNP rs81416363 ni el ensayo dúplex dirigido al SNP g.299084751 C > T permiten por sí solos la discriminación inequívoca de jabalí y cerdo doméstico. Sin embargo, si se tienen en cuenta los resultados de los dos ensayos singleplex y del ensayo dúplex, el poder de discriminación puede aumentar drásticamente. Nuestros resultados demuestran que si los dos ensayos para la misma subespecie (por ejemplo, assayChr9D y assayChr1D) conducen a una clasificación idéntica (en el ejemplo dado de cerdo doméstico), y los resultados obtenidos con los dos ensayos para la otra subespecie (en el ejemplo dado de assayChr9W y assayChr1W) son ambiguos, la probabilidad de clasificación errónea es baja si se confía en los resultados que son idénticos. Siguiendo esta estrategia, 86 (91,5%) de los 94 individuos pudieron ser asignados correctamente.