Are snakes right-handed ? Asymmetry in hemipenis size and use in gartersnakes (Thamnophis sirtalis)

Abstract

Maleilla on parittaiset lisääntymisjärjestelmät (kivekset, efferentit kanavat, hemipenikset ja niihin liittyvät munuaiskomponentit), joista riippumaton sarja sijaitsee kummallakin puolella kehoa. Tutkimuksemme sukkanauhakäärmeillä (Thamnophis sirtalis parietalis) paljastavat merkittävää morfologista epäsymmetriaa tässä järjestelmässä : oikeanpuoleisen vartalon kivekset, munuaiset ja hemipeneet ovat suurempia kuin vasemmanpuoleiset. Maastossa ja ulkotiloissa tehdyistä parituksista saadut tiedot viittaavat siihen, että tämä epäsymmetria vaikuttaa lisääntymiskäyttäytymiseen ja mahdollisesti lisääntymismenestykseen. Kopulaatiot, joissa käytettiin oikeanpuoleista hemipenistä, tuottivat suuremman hyytelömäisen ”parittelutulpan”, ja se saattaa siten tehokkaammin viivyttää naaraan uudelleenparittelua. Vaikka kummankin hemipeniksen käyttö kenttäparittelussa oli keskimäärin lähes 50/50, hemipeniksen käyttö ei ollut satunnaista. Uroksilla oli taipumus vuorotella hemipeniksen käyttöä peräkkäisissä pariutumisissa, mikä johtui ehkä tulppamateriaalin ehtymisestä. Lisäksi urospuoliset sukkanauhakäärmeet käyttivät mieluummin suurempaa (oikeanpuoleista) hemipenistä parittelussa korkeissa ruumiinlämpötiloissa, ehkä siksi, että ne pystyvät näissä olosuhteissa tekemään hienovaraisempia asentosäätöjä (ja siten valitsemaan paremman systeemin).

Jopa pinnallisesti symmetrisissä eliöissä on lähes aina jonkinlainen johdonmukainen poikkeama absoluuttisesta symmetriasta. Tällaisia poikkeamia esiintyy paitsi anatomiassa myös käyttäytymisessä. Monet eläimet käyttävät johdonmukaisesti joko oikeaa tai vasenta kättään (tai jalkaansa tai tassuaan) mieluummin kuin vastaavaa ruumiinosan toiselta puolelta (Bock ja Marsh, 1991), kun niille annetaan siihen mahdollisuus. Ensisilmäyksellä käsite ”kätisyys” ei sovellu täysin raajattomiin eläimiin, ja siksi on vaikea kuvitella oikeakätistä käärmettä. Käärmeillä (tai ainakin uroskäärmeillä) on kuitenkin yksi parittaisten lisäkkeiden sarja, jossa voisi mahdollisesti esiintyä tällaista lateralisaatiota. Kullakin uroksella on kaksi intromittentiaalista elintä (hemipenejä), yksi kummallakin puolella kehoa, joista vain toinen kääntyy yhden kopulaation aikana (Crews ja Moore, 1986 ; Dowling ja Savage, 1960 ; Murphy ja Barker, 1980).

Asymmetria hemipenien koossa ja käytössä squamate-matelijoilla on erityisen mielenkiintoinen, koska uroksen ruumiin kummallakin puolella olevat lisääntymiselimet ovat täysin erillisiä, toisin kuin monet muut epäsymmetriset rakenteet, kuten keuhkot. Toisin sanoen oikeassa kiveksessä tuotetut siittiöt voivat poistua kehosta vain oikean hemipeniksen kautta (esim. Dowling ja Savage, 1960). Näin ollen kaikki poikkeamat uroksen lisääntymisrakenteiden mittasuhteissa kahdenvälisestä symmetriasta voivat suoraan vaikuttaa kopulaation tehokkuuteen – ja näin ollen myös siihen, millainen kuntohyöty todennäköisesti koituu vasemmanpuoleisella ja oikeanpuoleisella hemipeniksellä tapahtuvasta keinosiemennyksestä. Uros, joka käyttää mieluummin suurempaa hemipenistään, joka on kiinnittynyt suurempaan kivekseen, saattaa siten suoraan lisätä geneettistä edustustaan seuraavassa sukupolvessa.

MENETELMÄT

Tutkimme punasivuisia sukkanauhakäärmeitä (Thamnophis sirtalis parietalis) Manitoban keskiosassa Kanadassa (Chatfieldin yhteislaitumella ; ks. kohta Mason ja Crews, 1985) niiden pariutumisaikana toukokuussa 1997 ja toukokuussa 1998. Tällä alueella käärmeet parittelevat välittömästi sen jälkeen, kun ne ovat nousseet esiin suurista yhteisistä talvehtimispesistä, joten kosiskeluun ja paritteluun liittyy usein monien käärmeiden muodostamia ”palloja” (Mason ja Crews, 1985). Tämä artikkeli perustuu kahteen aineistoon: toinen koskee lisääntymisjärjestelmän morfologista epäsymmetriaa ja toinen vasemman ja oikean puoliskon suhteellista käyttöä kopulaatiossa.

Morfologiset tietomme perustuvat 90 aikuisen uros sukkanauhakäärmeen paloitteluun, jotka kuolivat 8. toukokuuta 1997 eräässä luolassa tapahtuneessa joukkokuolemassa. Epätavalliset sääolosuhteet saivat käärmeet muodostamaan yhden valtavan ryhmän luolan lattialle, ja niiden alapuolella olevat käärmeet tukehtuivat niiden yläpuolella olevien käärmeiden massaan. Löysimme käärmeet muutaman tunnin kuluessa niiden kuolemasta, säilytimme niiden ruhot lumihangessa yön yli ja paloittelimme ne seuraavana päivänä. Kirjasimme ylös kuonon venttiilin pituuden (SVL) ja ruumiin massan, minkä jälkeen avasimme käärmeen ruumiinontelon keskiviillolla, jotta pystyimme mittaamaan kivesten ja munuaisten pituuden ja leveyden molemmin puolin ruumista. Osa munuaisista (sukupuolisegmentti) tuottaa eritteitä, jotka sekoittuvat siittiöiden kanssa (Devine, 1975 ; Saint Girons, 1957); koska emme pystyneet erottamaan sukupuolisegmenttiä selvästi, mittasimme koko munuaisen. Hemipenit avattiin kokonaan puristamalla häntää, ja näiden paritteluelinten pituudet ja leveydet kirjattiin ylös. Jäljempänä käytämme termiä ”oikeanpuoleinen puoli” käärmeen näkökulmasta ; vaikka tämä seikka saattaa tuntua itsestään selvältä, se on helppo sekoittaa, koska käärmeet asetetaan tyypillisesti selkäpinnalleen paloittelua varten; näin ollen käärmeen oikeanpuoleinen puoli muuttuu tutkijan vasemmanpuoleiseksi.

Vasemman ja oikean puoliskon käyttömallien kvantifioimiseksi kirjasimme nämä tiedot kahdenlaisista paritteluista ; niistä, jotka tapahtuivat luonnollisesti (luolissa ja niiden välittömässä läheisyydessä), ja niistä, jotka tapahtuivat paritteluareenoilla, jotka olimme pystyttäneet kontrolloidaksemme parittelevien urosten lukumäärää ja tyyppejä. Näitä kokeita varten asetimme juuri pyydystetyt käärmeet (1, 2, 4 tai 24 urosta ja yhden parittelemattoman naaraan) nailonista valmistettuihin paritteluareenoihin (1,0 × 1,2 m) kenttäpaikkamme lähelle ja annoimme niiden paritella. Vaihtelevia urosten määriä naarasta kohti käytettiin kokeessa, jossa testattiin, vaikuttaako operatiivinen sukupuolisuhde urosten parittelumenestykseen vaikuttaviin tekijöihin (Shine ym., 2000). Operatiiviset lämpötilat mitattiin Hobo-temp-tiedonkeruulaitteilla 10 minuutin välein koko tutkimuksen ajan kuolleiden käärmeiden sisälle (toukokuussa 1997) tai onttoihin kupariputkiin (toukokuussa 1998) aitausten viereen sijoitettujen termoparien avulla. Vuoden 1998 kokeissa arvioimme käärmeiden toimintalämpötiloja mallilämpötilojen sekä käärmeiden lämmitys- ja jäähdytysnopeuksia koskevien tietojen perusteella. Lukuun ottamatta pientä osajoukkoa toistuvia paritteluja (jotka analysoidaan erikseen muista tietokokonaisuuksista), yksikään yksittäinen uros- tai naaraskäärme ei ollut edustettuna useammassa kuin yhdessä parittelussa. Näin ollen kaikki parittelut käsittävät tilastollisesti riippumattoman aineiston.

TULOKSET

Sukupuolielinten koon epäsymmetria

90 täysikasvuisen uroskäärmeen kohdalla havaittiin huomattavia kokoeroja ruumiin molemmin puolin sijaitsevien elinten välillä (kuva 1). Oikeanpuoleiset lisääntymisrakenteet olivat keskimäärin huomattavasti suurempia kuin vasemmanpuoleiset. Käyttämällä parittaisia t-testejä, joissa oli 89 vapausastetta, oikeanpuoleinen hemipenis oli leveämpi (t = 2,82, p <.006), ja oikeanpuoleinen kives oli sekä pidempi (t = 8,05, p <.0001) että leveämpi (t = 2,46, p <.02). Hemipeniksen pituudet (t = 1.63, p =.11) eivät eronneet merkitsevästi näiden kahden puolen välillä. Epäsymmetriaa esiintyi myös munuaisissa (oikealla suurempi : pituus, t = 4.88, p <.0001 ; leveys, t = 0.40, p =.69).

Käytön epäsymmetria

Kenttäparitukset

Kentällä copulossa havaituissa paritetuissa paritetuissa paritetuissa uroksissa suunnilleen yhtä moni uros käytti oikeaa kuin vasenta hemipenistään. Toukokuussa 1997 kirjattiin 161 tällaista paria, joista 74:ssä (46 %) käytettiin oikeaa hemipenistä (nollatilanteessa 50 %, binomitesti, z = 0,95, p =,34). Toukokuussa 1998 kirjasimme 44 paria, joista täsmälleen puolet (22 paria) käytti oikeaa hemipenistä.

Etsimme korrelaatioita oikean ja vasemman hemipeniksen käytön välillä näissä pareissa sekä yhdistetyssä aineistossa että jokaisena vuonna erikseen, mutta emme havainneet merkitseviä eroja kumpaakaan hemipenistä käyttäneiden parittelujen välillä uroksen tai naaraan ruumiinkoon (SVL, massa) suhteen (yhden faktorin ANOVA-analyysi, p >.50 kaikille ominaisuuksille). Aineistomme eivät myöskään paljasta mitään ilmeistä alueellista (elinympäristöön liittyvää) vaihtelua hemipeniksen valinnassa: niiden parittelujen osalta, joissa kirjasimme parien sijainnit, käyttötavat olivat samankaltaisia luolan sisällä (25 vasenta/18 oikeaa) ja ympäröivillä niityillä (21 vasenta/19 oikeaa).

Areenakokeet

Vuonna 1997 kirjatuissa areenaparituksissa oikeaa hemipenistä käytettiin 61 %:ssa (52 kpl 85:stä) pariutumisista, mikä on lähes merkitsevä poikkeama 50 %:n nollaodotuksesta (binomitesti, z = 1.95, p =.051). Sitä vastoin vuoden 1998 areenalla tapahtuneissa astutuksissa kumpaakin puoliskoa käytettiin lähes yhtä paljon: kirjattiin yhteensä 80 astutusta, joissa käytettiin vasenta puoliskoa, ja 79, joissa käytettiin oikeaa puoliskoa (49,7 % käytti oikeaa puoliskoa, kun nollatulos oli 50 %, z = 0, p >.90). Kaksi vuotta eivät eronneet merkittävästi oikeaa ja vasenta hemipenistä käyttävien parittelujen suhteellisissa lukumäärissä (X2 = 2,50, 1 df, p =.11).

Tarkastelimme näitä tietoja yksityiskohtaisemmin etsiessämme mahdollisia hemipeniksen valinnan korrelaatioita. Kuten kenttäparituksissa, emme havainneet merkitseviä vinoutumia hemipeniksen käytössä uroksen tai naaraan ruumiinkoon suhteen (p >.50). Areenakokeiden laajemmat tiedot (koska tiesimme, milloin ja missä kopulaatio alkoi ja päättyi) mahdollistivat kuitenkin lisämuuttujien testaamisen tällä tavoin. Kopulaation kesto oli samankaltainen kummankin hemipeniksen parittelussa (keskiarvo = 13,7 min, SD = 4,97 vasemman hemipeniksen osalta verrattuna 19,6 ± 11,1 min oikean hemipeniksen osalta, Mann-Whitney U = 24,0, z = 1,13, p =,26). Uroksen hemipenisvalinta ei riippunut muiden urosten määrästä, joiden kanssa se kilpaili kosiskelusta. Kosiskelun kesto ennen intromissiota ei vaikuttanut uroksen hemipeniksen valintaan ; tämä kesto vaihteli kokeiden välillä, mutta se ei eronnut merkitsevästi vasemman- ja oikeanpuoleista hemipenistä käyttävien parittelujen välillä missään kokeessa (p >.40 kaikissa vertailuissa).

Semipeniksen käyttö areenakokeissa ei kuitenkaan ollut satunnaista : ”oikeanpuoleiseen käteen” suuntautuvan vinoutuman suuruus riippui lämpöolosuhteista. Urokset käyttivät vasenta ja oikeaa hemipenistä suunnilleen samassa suhteessa, kun sää oli suhteellisen viileä, mutta osoittivat voimakasta oikeanpuoleista taipumusta lämpimissä olosuhteissa (kuva 2). Tämä tulos käy parhaiten ilmi logistisesta regressiosta, jossa ympäristön (operatiivinen) lämpötila on riippumaton muuttuja ja oikean ja vasemman puoliskon käyttö riippuvainen muuttuja. Lämpötilan vaikutusta hemipeniksen valintaan koskeva log-likelihood ratio -testi antoi chi-neliöarvoksi 6,92 (1 df, p = 0,0085). Kuvio oli ilmeinen molempina tutkimusvuosina.

Hemipeniksen käytön valinta voi riippua myös uroksen aiemmasta paritteluhistoriasta. Yhdessä koesarjassa annoimme urosten paritella toistuvasti useiden naaraiden kanssa, jotta voisimme kirjata, mitä hemipenistä käytettiin peräkkäisissä parituksissa. Näissä kokeissa uroksilla oli voimakas taipumus vuorotella hemipeniksen käyttöä, kun ne parittelivat useammin kuin kerran yhden päivän aikana (vuorottelivat 7:ssä tapauksessa 8:sta ; nollatilanteessa 50/50, X2 = 4.50, 1 df, p <.05). Kuitenkin peräkkäisissä pariutumisissa, joiden välillä oli > 12 tuntia (eli peräkkäisinä päivinä), samaa hemipenistä käytettiin kahdessa neljästä tapauksesta. Näin ollen urokset saattavat vuorotella hemipeniksen käyttöä pääasiassa silloin, kun ne parittelevat nopeasti peräkkäin. Poistimme myös parittelutulpat (Devine, 1975) näistä naaraista jokaisen parittelun jälkeen, jotta pystyimme vertailemaan kustakin hemipenestä tuotettujen tulppien kokoa (massaa). Oikeasta hemipeniksestä saadut tulpat olivat keskimäärin huomattavasti suurempia (keskiarvo = 0,08 g, SD = 0,03, n = 14) kuin vasemmasta hemipeniksestä saadut tulpat (keskiarvo = 0,06 g, SD = 0,03, n = 11 ; F1,23 = 4,62, p <.05). Kenttäparituksista saatujen parittelutulppien massa ei kuitenkaan eronnut merkitsevästi toisistaan riippuen siitä, kumpaa hemipenistä käytettiin (F1,41 = 1.22, p =.28).

KESKUSTELU

On jo pitkään tiedetty, että käärmeiden sisäisessä anatomiassa on huomattavaa epäsymmetriaa, ja tämä pätee sekä asentoon (anteriorinen-posteriorinen) että monien sisäelinten, kuten kiveksien ja munuaisten, kokoon (esim, Bergmann, 1951, 1958 a, b ; Wallach, 1991). Tietomme osoittavat, että tämä epäsymmetria ulottuu myös hemipenikseen, ainakin Thamnophis sirtalis parietalis -lajilla, ja että se saattaa liittyä hemipeniksen käytön ei-sattumanvaraiseen valintaan tässä lajissa.

Tämän aihepiirin aiemmat tutkimukset ovat olleet rajallisia (erityisesti kenttäparitusten osalta), mutta tulokset ovat yhdenmukaisia tutkimuksemme kanssa. Esimerkiksi kenttäparituksissa molempien hemipenien kokonaiskäyttö oli noin 50/50, kuten samaa lajia koskevassa aiemmassa tutkimuksessa (Blanchard ja Blanchard, 1941) todettiin; tämä saattaa olla yleinen sääntö konnaeläimillä (Crews, 1978; Secor, 1987; Tokarz ja Slowinski, 1990; Zweifel, 1980, 1997). Vaikka hemipenejä käytetään yleisesti ottaen yhtä paljon, on kuitenkin selvää, että uroksen valinta vasemman ja oikean hemipeniksen välillä kopulaatiota varten ei ole sattumanvaraista. Aiemmat kirjoittajat ovat arvelleet, että uroskäärmeet yksinkertaisesti käyttävät sitä hemipenistä, joka on lähimpänä naaraan kloakkaa (esim. Murphy ja Barker, 1980 ; Secor, 1987). Tämä saattaa usein pitää paikkansa, mutta myös muilla tekijöillä on merkitystä.

Suoraviivaisin vaikutus hemipeniksen käyttöön on uroksen aiempi paritteluhistoria. Tutkimuksemme viittaa siihen, että urokset käyttävät vuorotellen molempia hemipenejään joissakin tilanteissa mutta eivät toisissa, riippuen edellisestä parittelusta kuluneesta ajasta. Muilla konnaeläinlajeilla on raportoitu urosten taipumuksesta käyttää vuorotellen kumpaakin hemipenistä ainakin silloin, kun tarjolla on useita parittelumahdollisuuksia nopeasti peräkkäin (esim. Olsson ja Madsen, 1998 ; Tokarz ja Slowinski, 1990 ; Zweifel, 1981, 1987). Tämän vuorottelun perimmäinen valikoiva etu voi olla siittiöiden ehtyminen monilla lajeilla (Tokarz ja Slowinski, 1990 ; Zweifel, 1981, 1987), mutta tätä väitettä ei voida soveltaa sukkulakäärmeisiin. Thamnophis sirtalis parietalis -urokset tuottavat siittiöitään useita kuukausia ennen parittelua, ja niiden kivekset ovat passiivisia parittelukauden aikana (esim. Crews ja Moore, 1986). Kuitenkin sukkanauhakäärmeet siirtävät myös munuaiseritteitä (parittelutulpan muodostamiseksi) parittelun yhteydessä (Devine, 1975). Näin ollen on olemassa muutakin ainetta kuin siittiöitä, joita on mahdollisesti vaikea tuottaa riittävän nopeasti kahteen nopeasti peräkkäin tapahtuvaan paritteluun. Tämän hypoteesin mukaisesti toistuvista parittelukokeista saadut tiedot (ks. edellä) viittaavat siihen, että parittelutulpan massa voi olla pienempi toisista kopulaatioista kuin ensimmäisistä kopulaatioista. Tulpan massa väheni ensimmäisestä toiseen paritteluun yhdeksällä uroksella, pysyi samana kahdella uroksella eikä kasvanut yhdelläkään uroksella (binomitestiä käyttäen, p =.03). Vastaavasti siirrettyjen siittiöiden määrä kopulaatiota kohti laski nopeasti toisella squamate-lajilla (anoliinilisko), kun urokset pakotettiin käyttämään samaa hemipenistä useissa nopeasti peräkkäisissä paritteluissa (Tokarz ja Slowinski, 1990).

Yllättävämpää oli, että hemipeniksen käyttö liittyi vahvasti ympäristön lämpöolosuhteisiin, mikä viittaa siihen, että urosmaiset käärmeet säätävät fakultatiivisesti hemipeniksen käyttöä suhteessa lämpöolosuhteisiin liittyviin vaikutuksiin. Tulkitsemme tämän mallin tarkoittavan, että käärmeet käyttävät mieluummin suurempaa (oikeanpuoleista) hemipenistä, jos ne pystyvät siihen vaarantamatta parittelumahdollisuuksia. Korkeat ruumiinlämpötilat parantavat tämän lajin karkeaa liikkumiskykyä (Heckrotte, 1967) ja todennäköisesti myös uroksen kykyä tehdä hienovaraisia asennonmuutoksia (kuten pyrstöpohjan siirtäminen naaraan toiselta puolelta toiselle) menettämättä asemaansa kilpailussa muiden urosten kanssa.

Sukkanauhakäärme-urokset, jotka käyttävät oikeaa hemipenistään tällaisissa olosuhteissa, saattavat olla etulyöntiasemassa, koska hemipenis on leveämpi ja se on yhteydessä suurempaan siittiöiden lähteeseen (kiveksiin) ja liitännäiseritteisiin (munuaisiin). Hyöty on kuitenkin todennäköisesti vaatimaton, varsinkin kun otetaan huomioon, että suotuisasta asennosta luopuminen ja vartalon suuntaaminen uudelleen kosiskelun aikana aiheuttavat kuntorangaistuksen. Näin ollen urokset käyttävät usein vasenta hemipenistä erityisesti silloin, kun ne ovat suhteellisen kylmiä (ja siten vähemmän kykeneviä suorittamaan monimutkaisia pariutumismanöövereitä) tai kun ne ovat hiljattain kuluttaneet siemennestettä ja tulppamateriaalia oikeanpuoleisesta kopulaatiojärjestelmästä.

Vaikka aineistomme on kattavin saatavilla oleva aineisto, joka koskee urosten lisääntymisjärjestelmän rakenteen ja toiminnan epäsymmetrisyyttä kyykkäeläimillä, monia arvoituksia on edelleen jäljellä, ja jotkin tuloksistamme olivat näytteiden välillä ristiriitaisia. Esimerkiksi tulppamassa oli suurempi oikeanpuoleisen puoliskon parituksista areenoilla, mutta ei kentällä. Emme tiedä, miksi tämä ero on olemassa. Yksi mahdollisuus on, että pieni määrä uroksia saa suuren osan parituksista kenttäolosuhteissa; jos näin on, monet kentällä paritetuista uroksistamme ovat saattaneet käyttää samaa hemipenistä jo aiemmassa parittelussa. Näin ollen nämä urokset tuottaisivat todennäköisesti pienemmän parittelupistokkaan toisella kerralla. Jos uroksilla on taipumus käyttää oikeaa hemipenistä ensimmäisessä parittelussaan, tällainen suuntaus pienentäisi näennäisiä eroja parittelupistokkeiden massoissa oikean ja vasemman hemipeniksen välillä. Tämä mahdollisuus on kuitenkin täysin spekulatiivinen.

Vielä tärkeämpää on, että johtopäätöksemme joko oikean- tai vasemmanpuoleista järjestelmää käyttävien parittelujen kuntohyödyistä jäävät myös spekulatiivisiksi. Meillä ei ole suoraa näyttöä siitä, että suurempi hemipenis (ja siihen liittyvät kivekset, munuaiset ja pariutumistulppa) olisi itse asiassa tehokkaampi kopulaatioväline kuin pienempi yksikkö. Hemipeniksen käytön ei-sattumanvaraiset mallit viittaavat kuitenkin siihen, että epäsymmetria ei ole vähäpätöinen, ja jatkotyö näiden kysymysten selvittämiseksi olisi erittäin kiinnostavaa. Itse asiassa kätisyyden ja lisääntymismenestyksen välinen mahdollisesti suora yhteys tässä järjestelmässä (yhteys, joka on paljon heikompi useimpien muiden lateralisoitumisen esimerkkien kohdalla) viittaa siihen, että tämä ilmiö voi tarjota arvokkaan mallijärjestelmän, jonka avulla voidaan tutkia bilateraalisesta symmetriasta poikkeamisen fitness-vaikutuksia.

Kiitämme R. Nesbittia, A. Cuddya, A. ja G. Johnsonia avusta ja D. Robertsia logistisesta tuesta. Thomas Madsen ja David O’Connor antoivat kommentteja käsikirjoituksesta. Taloudellista tukea antoivat Australian tutkimusneuvosto (R.S.) ja National Science Foundation National Young Investigator Award (IBN-9357245) sekä Whitehall Foundation (W95-04) R.T.M. Tutkimus suoritettiin Oregonin osavaltionyliopiston institutionaalisen eläintenhoito- ja käyttökomitean pöytäkirjan nro mukaisesti. LAR-1848B. Kaikki tutkimukset tehtiin Yhdysvaltain kansanterveyslaitoksen ”Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals” ja National Institutes of Healthin ”Guide to the Care and Use of Laboratory Animals” -oppaan mukaisesti.