Enzyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) on immunologinen määritys, jota käytetään yleisesti vasta-aineiden, antigeenien, proteiinien ja glykoproteiinien mittaamiseen biologisista näytteistä. Esimerkkejä ovat HIV-infektion diagnosointi, raskaustestit ja sytokiinien tai liukoisten reseptorien mittaaminen solujen supernatantista tai seerumista. ELISA-määritykset tehdään yleensä 96 kuoppalevyissä, jolloin yhdellä kokeella voidaan mitata useita näytteitä. Näiden levyjen on oltava erityisiä absorboivia levyjä (esim. NUNC Immuno -levyt), jotta varmistetaan, että vasta-aine tai antigeeni tarttuu pintaan. Kukin ELISA-testi mittaa tiettyä antigeenia, ja sarjoja useille eri antigeeneille on laajalti saatavilla.
Kuvassa 1 esitetty ELISA-testi on niin sanottu sandwich-ELISA, jossa käytetään kahta vasta-ainesarjaa erittyneiden tuotteiden, esim. sytokiinien, havaitsemiseksi. Menetelmä on vaiheittainen kuvan mukaisessa järjestyksessä. Ensimmäinen vaihe on ELISA-levyn päällystäminen sieppausvasta-aineella, minkä jälkeen ylimääräinen, sitoutumaton vasta-aine pestään levystä. Sieppausvasta-aine on vasta-aine, joka on kasvatettu kiinnostuksen kohteena olevaa antigeenia vastaan.
Kuvaus 1. ELISA-menetelmä. Yllä on kuvattu sandwich-ELISA-menetelmä, jossa näytteen vaiheet on numeroitu järjestyksessä 1-4.
Seuraavaksi lisätään näyte (esim. virtsa, seerumi tai solujen supernatantti). Näytteestä löytyvä antigeeni sitoutuu jo levyn pinnoitteena olevaan sieppausvasta-aineeseen. Näytteet lisätään yleensä kahtena tai kolmena kappaleena (tilastollisen analyysin mahdollistamiseksi) ja vaihtelevina pitoisuuksina sen takaamiseksi, että ne ovat määrityksen havaitsemisrajojen sisällä. Ylimääräinen näyte pestään jälleen levystä.
Vaiheessa 3 lisätään detektiovasta-aine. Tämä vasta-aine on leimattu entsyymillä, yleensä hevosretiisiperoksidaasilla tai emäksisellä fosfataasilla. Detektiovasta-aine sitoutuu jo levylle sitoutuneeseen kohdeantigeeniin. Lopuksi levylle lisätään substraatti. ELISA-määritykset ovat yleensä kromogeenisia, ja niissä käytetään reaktiota, jossa substraatti (esim. TMB tai ABTS) muuttuu värilliseksi tuotteeksi, joka voidaan mitata levynlukulaitteella.
Näytteen antigeenipitoisuuden määrittäminen edellyttää vakiokäyrän tuottamista käyttäen tunnetun pitoisuuden antigeenejä (esitetty kuvassa 2). Antigeenin pitoisuus näytteessä voidaan sitten laskea optisen tiheyden (OD) avulla.
Kuva 2. Tyypillinen standardikäyrä. Kuvassa on IFN-γ-ELISA:n standardikäyrä. Antigeenin pitoisuuden selvittämiseksi näytteessä on laadittava standardikäyrä käyttäen tunnetun pitoisuuden liuosta.