Rajoitus-modifikaatio
Rajoitus-modifikaatiojärjestelmiä (RM) esiintyy kaikkialla prokaryoottisessa valtakunnassa, jossa ne toimivat puolustusjärjestelminä vierasta DNA:ta vastaan. Tällä hetkellä tunnetaan 47 tyypin I, 3320 tyypin II ja kahdeksan tyypin III järjestelmää. R. Roberts (Beverly, MA) huomautti, että viime aikoihin asti restriktioentsyymit oli tunnistettu hankkimalla bakteereja viljelykokoelmista ja ympäristönäytteistä ja analysoimalla niiden restriktioaktiivisuutta. Nyt on mahdollista seuloa uusia DNA-sekvenssejä DNA-metyylitransferaasigeenien (MTaasigeenien) varalta, jotka voidaan tunnistaa niiden konservoituneiden motiivien perusteella, ja etsiä sitten niihin liittyviä geenejä. Nämä ovat hyviä ehdokkaita restriktioendonukleaasigeeneiksi, koska DNA-metyylitransferaasien ja restriktioendonukleaasien geenit ovat usein yhteydessä toisiinsa. Viimeaikaisissa genomihankkeissa on tällä tavoin tunnistettu odottamattoman suuri määrä oletettuja RM-järjestelmiä. Esimerkiksi Helicobacter pylori -bakteerin genomista tunnistettiin 25 erilaista MTaasigeeniä, ja osa niistä liittyi restriktioentsyymigeeneihin. Tietokantojen seulonnasta voi siis tulla hyvin tuottava menetelmä sellaisten restriktioentsyymien löytämiseksi, joilla on uusia spesifisyyksiä. A. Piekarowicz (Varsova, Puola) raportoi yhdestä esimerkistä tällaisesta lähestymistavasta, joka johti uuden tyypin IC restriktioentsyymin, NgoAXVI:n, tunnistamiseen.
Tyypin I ja III restriktioentsyymit sekä metyyliriippuvainen McrBC-entsyymi vaativat kaksi tunnistuskohtaa ja ovat riippuvaisia ATP:n (McrBC: GTP) hydrolyysistä DNA:n pilkkomiseen (katsaus artikkelissa Rao et al., 2000). Halkaisu tapahtuu, kun kaksi tällaista entsyymiä törmää toisiinsa siirtäessään DNA:ta, mikä selittää kahden tunnistuskohdan vaatimuksen (kuva (kuva2).2). T. Bickle (Basel, Sveitsi) osoitti, että tyypin I entsyymejä ja McrBC:tä voidaan myös stimuloida pilkkomaan DNA:ta, kun ne törmäävät epäspesifiseen estoon. Tyypin III entsyymit sitä vastoin estyvät tällaisista lohkoista, koska kukin translokoituva entsyymi leikkaa vain yhtä säiettä ja tarvitsee toisen entsyymin yhteistyötä molempien DNA-juosteiden pilkkomiseen.
Kuva2. Malli sellaisten restriktioentsyymien aktivoitumisesta, jotka vaativat ATP:tä (tai GTP:tä) DNA:n pilkkomiseen. Kun kaksi entsyymimolekyyliä (tai kompleksia) on sitoutunut lineaarisen DNA-molekyylin kahteen tunnistuskohtaan, DNA siirtyy aktiivisessa, energiasta riippuvassa prosessissa, joka vaatii järjestelmästä riippuen ATP:tä tai GTP:tä. Tällä tavoin DNA:ta kierretään ulos. Halkaisu tapahtuu kahden translokaatiokompleksin törmäyksen jälkeen satunnaisissa kohdissa tunnistuskohtien läheisyydessä (tyypin III entsyymit ja McrBC) tai kauempana niistä (tyypin I entsyymit).
Vaikka useimmat tyypin II restriktioentsyymit ovat homodimeerejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa yhden kopionsa palindromisen tunnistuskohdan kanssa, on olemassa myös alatyyppejä, jotka vaativat kahden tunnistuskohteen yhteistoimintayhteistyönä toteutettavaksi (katsaus teoksessa Pingoud ja Jeltsch, 1997). Kuten S. Halford (Bristol, Yhdistynyt kuningaskunta) huomautti, tämä pätee paitsi tyypin IIe entsyymeihin, kuten NaeI, myös tyypin IIf entsyymeihin, kuten SfiI, ja tyypin IIS entsyymeihin, kuten FokI. Tyypin IIf entsyymit ovat homotetrameereja, joissa on kaksi erillistä DNA:n sitoutumiskohtaa, jotka kumpikin muodostuvat kahdesta alayksiköstä. SfiI on aktiivinen vain silloin, kun molemmat DNA:ta sitovat paikat ovat varattuja, mikä johtaa molempien paikkojen samanaikaiseen pilkkomiseen. FokI:n osalta, joka koostuu pilkkomis- ja tunnistusdomeenista, osoitettiin aiemmin, että entsyymin dimeeristyminen DNA:lla on välttämätöntä pilkkomisen tapahtumiseksi. Halford on nyt osoittanut, että tehokkaaseen pilkkomiseen tarvitaan kaksi tunnistuskohtaa, koska kummankin tunnistuskohteen on oltava vuorovaikutuksessa tunnistussekvenssin kanssa. Kaikki kolme entsyymityyppiä toimivat optimaalisesti kahdella kohdalla samalla DNA:lla, jolloin ne vangitsevat DNA:n kohtien välissä olevaan silmukkaan.
Atotyyppisiä tyypin II restriktioentsyymejä löydetään edelleen. BbvCI on heterodimeerinen restriktioentsyymi, joka tunnistaa epäsymmetrisen sekvenssin. Alayksiköt ovat yksittäin inaktiivisia, mutta yhdessä aktiivisia. Tämän ansiosta on mahdollista luoda spesifisiä nikkelöinti-entsyymejä inaktivoimalla toinen alayksikkö paikkaohjatun mutageneesin avulla, kuten G. Wilson (Beverly, MA) on raportoinut. A. Janulaitis (Vilna, Liettua) sai samanlaisen tuloksen heterodimeerisen Bpu10I-restriktioentsyymin osalta. Hän onnistui myös lieventämään substraattispesifisyyttä Eco57I:llä, joka on monomeerinen restriktio- ja modifiointientsyymi, jolla on yksi kohdetunnistusalue. Tässä tutkimuksessa käytettiin satunnaista mutageneesiä sellaisen muunnoksen tuottamiseksi, joka vuorovaikuttaa kanonisen CTGAAG-kohdan lisäksi myös CTGGAG-kohtien kanssa. Tämän rennon spesifisyyden molekyyliperustaa ei ole vielä selvitetty. V. Siksnys (Vilna, Liettua) raportoi uuden IIs-tyypin restriktioentsyymin, BfiI:n, löytämisestä, joka ei ole riippuvainen kaksiarvoisista metalli-ioneista pilkkomisessa. Tämä entsyymi on sekvenssiltään samankaltainen Salmonella typhimuriumin epäspesifisen nukleaasin kanssa ja käyttää oletettavasti samanlaista katalyyttistä mekanismia.
A. Pingoud (Giessen, Saksa) käsitteli II-tyypin restriktioentsyymien ja homing-endonukleaasien DNA:n pilkkomismekanismia, joilla on yhteinen tehtävä, mutta joilla on yleensä erilainen rakenne ja jotka oletettavasti noudattavat erilaisia pilkkomismekanismeja. Vaikka monista restriktioentsyymeistä, joilla on yhteinen katalyyttinen motiivi, on saatavilla yksityiskohtaista rakennetietoa, katalyyttisestä mekanismista tai katalyysiin osallistuvien Mg2+-ionien määrästä ei ole yksimielisyyttä. Periaatteessa sama pätee myös muihin fosforyylitransferaaseihin, joilla on restriktioentsyymin kaltainen katalyyttinen keskus. Esimerkkejä tällaisista proteiineista ovat Vsr-korjausentsyymi (E. coli) ja Hjc-resolvaasi (Pyrococcus furiosus). Viimeksi mainitun kiderakenteen esitti K. Morikawa (Osaka, Japani) (kuva (kuva3).3). Sen sijaan HNH-perheeseen kuuluvien homing-endonukleaasien, kuten I-PpoI:n, DNA:n pilkkomismekanismi näyttää olevan paremmin selvitetty, koska rakennetietoa on saatavilla sekä vapaasta entsyymistä että entsyymi-substraatti- ja entsyymi-tuote-komplekseista sekä yksityiskohtaista biokemiallista tietoa kyseisestä entsyymistä ja sen sukuisista ββα-Me-sormi-superperheen entsyymeistä. Nämä entsyymit vaativat kofaktoriksi Mg2+-ionin, joka on sitoutunut konservoituneeseen Asn:iin. Hyökkäävän hydroksyyli-ionin tuottaa konservoitunut His, siirtymätilan stabilointiin osallistuu konservoitunut Arg ja poistuvan ryhmän protonoinnin mahdollistaa vesimolekyyli Mg2+ -ionin hydrataatiopallosta.
Kuva 3. Hjc:n ja Vsr:n restriktioendonukleaasipoimujen vertailu esimerkkinä rakenteiden säilymisestä entsyymeillä, joilla on samankaltaisia tehtäviä. Hjc:n ja Vsr:n nauhakaaviot on esitetty samassa orientaatiossa kahden rakenteen päällekkäin asettamisen jälkeen. Aktiivisen alueen jäännösten sivuketjut on korostettu, ja kaksi konservoitunutta Asp-jäännöstä on merkitty. Tämän kuvan ovat ystävällisesti toimittaneet T. Nishino ja K. Morikawa.
Bakteerit ovat kehittäneet RM-järjestelmiä bakteriofagien torjumiseksi. Nämä puolestaan ovat kehittäneet erilaisia keinoja paeta bakteerien RM-järjestelmien rajoituksia. D. Dryden (Edinburgh, Iso-Britannia) raportoi tulokset biokemiallisesta analyysistä, joka koski bakteriofagi T7:n geenin 0.3 proteiinia, joka on tyypin I restriktiomodifikaatioentsyymien estäjä. Tämä proteiini sitoutuu stoikiometrisesti restriktioentsyymiin ja pitkänomaisen muotonsa ja negatiivisen pintavarauksensa vuoksi täyttää oletettavasti kokonaan entsyymin DNA:n sitoutumiskohdan ja estää siten DNA:n sitoutumisen.
RM-järjestelmät koostuvat restriktioendonukleaaseista ja DNA:n metyylitransferaaseista (MTaasit) (katsaus teoksessa Cheng, 1995; Robertson ja Wolffe, 2000). Koska DNA:n metylaatiomalli kuitenkin lisää tietoa DNA:han ja laajentaa siten sen koodauskapasiteettia, MTaasit eivät ole vain restriktioentsyymien kumppaneita RM-järjestelmissä, vaan niillä on monia muita elintärkeitä tehtäviä. Prokaryooteissa niillä on tehtäviä DNA:n korjauksessa sekä geeniekspression ja DNA:n replikaation säätelyssä. Eukaryooteissa DNA-metylaatio johtaa yleensä geenien transkriptionaaliseen vaimentamiseen. Se osallistuu epigeneettisiin prosesseihin, kuten X-kromosomin inaktivointiin, leimautumiseen ja geenien säätelyyn. Kun havaittiin, että useat DNA-metaasit ovat välttämättömiä hiirten kehitykselle, DNA-metylaation merkitys on tullut laajalti hyväksytyksi.
X. Cheng (Atlanta, GA) esitteli Dnmt2-proteiinin rakenteen, joka saattaa olla ensimmäinen eukaryoottisen DNA-metaasin rakenne. Proteiinilla on MTaasi-foldi ja sillä on kaikki sille tyypilliset katalyyttiset motiivit, mutta siltä näyttää puuttuvan katalyyttinen aktiivisuus. Tämä herättää kysymyksiä siitä, onko kyseessä todella entsyymi ja mikä sen substraatti on (DNA, RNA vai jokin muu). Chengin ja A. Jeltschin (Giessen, Saksa) jatkokeskusteluissa eukaryoottisista entsyymeistä käsiteltiin Dnmt1-, Dnmt3a- ja Dnmt3b-entsyymejä. Molemmat puhujat kertoivat näiden valtavien (jopa 1700 aminohappojäännöstä käsittävien) entsyymien typistetyillä proteiineilla ja eristetyillä domeeneilla saaduista tuloksista sekä esittelivät puhdistettujen entsyymien entsymaattista analyysia koskevia tuloksia. Koska Dnmt1:n katalyyttinen domeeni (∼500 aminohappojäännöstä) ei ole aktiivinen eristetyssä muodossa, sen on oltava entsyymin muiden osien tiukassa valvonnassa. Tätä vuorovaikutusta saatetaan tarvita korkean spesifisyyden varmistamiseksi hemimetyloitua DNA:ta kohtaan. Alan edistyksestä huolimatta DNA:n metylaatioprosessi eukaryooteissa, erityisesti mekanismit, jotka luovat DNA:n metylaatiokuvion, tunnetaan edelleen huonosti.
Prokaryoottien DNA:n metylaatiosta tiedetään jonkin verran enemmän. R. Gumport (Urbana, IL) esitteli prokaryoottisen M.RsrI MTaasin rakenteen ja vahvisti oletuksen, että kaikkien MTaasien katalyyttisillä domeeneilla on yhteinen rakenne. S. Klimasauskas (Vilna, Liettua), D.N. Rao (Bangalore, Intia), Gumport ja Jeltsch keskustelivat neljän prokaryoottisen MTaasin (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI ja M.EcoRV) molekyylientsymologiasta. Näiden entsyymien katalyyttiseen sykliin kuuluu DNA:n ja kofaktorin sitoutuminen, kohdekohdan paikantaminen ja tunnistaminen sekä kompleksin konformaatiomuutokset, mukaan lukien emästen kääntyminen ja metyyliryhmien siirto (kuva (Kuva4).4). Yksityiskohtaiset erot tulivat ilmeisiksi; esimerkiksi substraatin ja kofaktorin sitoutumisjärjestys ja nopeutta rajoittava vaihe vaihtelevat eri MTaaseissa. 2-aminopuriini osoittautui hyväksi välineeksi analysoitaessa niiden konformaatiomuutosten kinetiikkaa, joita DNA käy läpi kompleksissa MTaasien kanssa, mukaan lukien emäksen flippaus.
Kuvio4. Restriktio-endonukleaasien ja DNA-metyylitransferaasien suorittaman kohdepaikan paikantamisen mekanismi. Ensin DNA sitoutuu epäspesifisesti, minkä jälkeen kohdekohta paikannetaan helpotetun diffuusion (liukumisen ja hyppimisen) avulla DNA:lla. Kontaktit kohdekohtiin aiheuttavat entsyymin ja DNA:n konformaatiomuutoksia, jotka puolestaan käynnistävät katalyysin. Tämä mekanismi on yleinen useimmille entsyymeille, jotka ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa DNA:n kanssa.