Villisikojen ja kotieläimenä pidettävien sikojen erottaminen elintarvikkeissa reaaliaikaisella PCR:llä kahteen geenilokukseen kohdistamalla

Primerin ja koettimen suunnittelu

Valitsimme alukkeen ja koettimen suunnittelua varten polymorfismit, joiden on jo raportoitu mahdollistavan luonnonvaraisten villisikojen ja kotieläimenä pidettävien sikojen erottamisen. Aloitimme NR6A1-geenin SNP:stä g.299084751 C > T, jonka on todettu olevan yhteydessä rinta- ja lannerangan nikamien lukumäärään: villisioilla, jotka ovat homotsygoottisia villityyppiselle alleelille g.299084751 C, on 19 nikamaa, kun taas kotieläiminä pidettävillä sioilla, jotka ovat homotsygoottisia alleelille g.299084751 T, on 21-23 selkärankaa. Fontanesi ym. tutkimuksessa tätä SNP:tä käytettiin villisikojen ja kotieläimenä pidettävien sikojen erottamiseen PCR-RFLP:n avulla10. Tavoitteena oli suunnitella yksi alukepari kohdealueen monistamista varten sekä villisialla että kotieläimenä pidettävällä sialla ja kaksi TaqMan-koetinta, jotka olivat spesifisiä villisian alleelille (g.299084751 C) ja kotieläimenä pidettävän sian alleelille (g.299084751 T). Dupleksimäärityksen avulla pitäisi olla mahdollista havaita villisika ja kotisika samanaikaisesti samassa kuopassa. Suunnittelimme yhteensä neljä eteenpäin suuntautuvaa aluketta, kolme taaksepäin suuntautuvaa aluketta, neljä villisika-anturia ja yhden kotisika-anturin ja yhdistimme ne 21:ksi aluketta/anturijärjestelmäksi (Chr1a – u, lisätaulukko 1). Primer/anturijärjestelmä Chr1a kohdistui NR6A1-geenin ylempään säikeeseen ja primer/anturijärjestelmät Chr1b-u alempaan säikeeseen. Kokeissa tutkittiin, olivatko alukkeet ja koetinjärjestelmät spesifisiä villisioille vai osoittivatko ne ristireaktiivisuutta kotieläiminä pidettyjen sianrotujen/risteytysten kanssa. Primer/anturijärjestelmä Chr1a johti ΔCt-arvoon ≥ 10,56 kotisian ja villisian välillä (lisätaulukko 2). Aloitin/anturijärjestelmien Chr1i – o ΔCt-arvot vaihtelivat välillä 8,65-11,19. Primer/anturijärjestelmät Chr1b – h ja Chr1p – t eivät lisänneet fluoresenssisignaalia kotieläiminä pidettyjen sianrotujen/risteytysten osalta. Koska alukkeen/anturin järjestelmä Chr1q johti alhaisimpaan Ct-arvoon (24,77; n = 2) villisialle, testasimme sen soveltuvuutta yhdessä kotieläimenä pidettävää sikaa koskevan TaqMan-anturin kanssa dupleksimääritysmuodossa (alukkeen/anturin järjestelmä Chr1u, lisätaulukko 1). Koska Ct-arvot olivat tyydyttävät sekä villisian (26,21, n = 2) että kotieläimenä pidetyn sian (27,90, n = 2) osalta, kaikki SNP:hen g.299084751 C > T kohdistuvat PCR-kokeet suoritettiin alukkeen ja koettimen järjestelmällä Chr1u. Jäljempänä duplex-reaaliaikaista PCR-määritystä kutsutaan nimellä assayChr1, joka koostuu kotieläimenä pidettävän sian määrityksestä assayChr1D, jossa on etummainen alukkeena Chr1f4, käänteinen alukkeena Chr1r2 ja koetin Chr1p1D, ja villisian määrityksestä assayChr1W, jossa on etummainen alukkeena Chr1f4, käänteinen alukkeena Chr1r2 ja koettimena Chr1p4W (kuvio 1). 1A.

Kromosomissa 1 sijaitsevan NR6A1-geenin osittaiset sekvenssit, joissa on SNP g.299084751. C > T, johon kohdistetaan dupleksitesti ”assayChr1”, ja (B) kromosomilla 9, jossa on SNP g.118314929 A > G (rs81416363), johon kohdistetaan kaksi singleplex-testiä ”assayChr9D” ja ”assayChr9W”. Nuolet osoittavat alukkeiden (tummanharmaa) ja koettimien (vaaleanharmaa) paikat. (A) Duplex assayChr1 sisälsi etummaisen alukkeen Chr1f4, käänteisen alukkeen Chr1r2, koettimen Chr1p4W ja koettimen Chr1p1D. (B) Singleplex-assayChr9D sisälsi eteenpäin suuntautuvan alukkeen Chr9f8, käänteisalukkeen Chr9r17D ja koettimen Chr9p2; singleplex-assayChr9W sisälsi eteenpäin suuntautuvan alukkeen Chr9f8, käänteisalukkeen Chr9r12W ja koettimen Chr9p2. Alalajispesifiset emäkset on esitetty lihavoituna (pystysuorat punaiset nuolet) ja mismatch-emäkset sinisellä (pystysuorat siniset nuolet).

Koska kirjallisuudesta olimme oppineet, että erotteluvoima kohdistamalla vain yhteen polymorfismiin ei todennäköisesti riitä, etsittiin lisää sopivaa geenipaikkaa. Tutkiessaan 20 SNP:n soveltuvuutta villisian ja kotisian erottamiseen toisistaan Beugin ym. olivat havainneet SNP:t rs80864596 (intergeeninen, kromosomi 5), rs80796712 (glykogeenisyntaasikinaasi 3-beta, kromosomi 13) ja rs81416363 (intergeeninen, kromosomi 9) suurimmaksi erottelukyvyksi11. Siksi valitsimme nämä kolme SNP:tä alukkeiden ja koettimien järjestelmien suunnitteluun. Verrattuna SNP:n g.299084751 C > T alukkeiden ja koettimien suunnitteluun noudatimme erilaista strategiaa. Sen sijaan, että olisimme sijoittaneet alalajikohtaisen emäksen koettimeen, sijoitimme sen toiseksi viimeiseen paikkaan etu- tai käänteisprimerin 5′-päästä. Spesifisyyden lisäämiseksi otimme käyttöön tarkoituksellisia emäsvirheitä. Tämän niin sanotun mismatch amplification mutation assay (MAMA) -tekniikan12,13 etuna on, että se on melko kustannustehokas, koska yksi ja sama koetin voidaan testata useilla alukkeilla, jotka eroavat toisistaan mismatch-aseman suhteen. Ensimmäisessä koesarjassa epäsuhtainen emäs lisättiin joko 3. tai 6. kohtaan alalajispesifistä emästä sisältävän alukkeen 3′-päästä. Kun olimme kehittäneet reaaliaikaisia PCR-määrityksiä metsäkaurista, metsäpeuraa ja sika-peuraa varten14,15,16 , tämä strategia oli osoittautunut onnistuneeksi. Tässä tutkimuksessa yksikään alukkeiden ja koettimien järjestelmistä (Chr5b-d, Chr13b-c, Chr9b-g, Chr9i-n, lisätaulukko 1) ei kuitenkaan mahdollistanut kotieläimenä pidettävän sian ja villisian erottamista toisistaan (lisätaulukko 3). Parhaat tulokset (ΔCt-arvo kotieläinrotujen/risteytysten ja villisian välillä ≥5,24) saatiin Chr9j:n alukkeella/anturijärjestelmällä. Tässä kromosomissa 9 sijaitsevaan SNP:hen rs81416363 kohdistuvassa alukkeen ja koettimen järjestelmässä epäsuhtainen emäs sijaitsi kolmannessa kohdassa alukkeen 3′-päästä (TTCACG → TTCCCG). Spesifisyyden lisäämiseksi lisäsimme lisää epäsuhtaa 4. (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) tai 5. kohtaan (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) alukkeen 3′-päästä. Lisävirheiden lisääminen osoittautui onnistuneeksi. Aloitin/koetinjärjestelmällä Chr9r (lisätaulukko 1) saatiin sekä alhaisin Ct-arvo villisialle (22,09; n = 2) että korkein ΔCt-arvo (10,52) kotieläimenä pidettyjen sianrotujen/risteytysten ja villisian välillä (lisätaulukko 3). Tämä reaaliaikainen PCR-määritys villisialle, joka kohdistui kromosomissa 9 sijaitsevaan SNP:hen rs81416363, perustui alukkeiden ja koettimien järjestelmään Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Seuraavaksi sovelsimme MAMA-strategiaa kehittääksemme vastaavan reaaliaikaisen PCR-määrityksen, joka kohdistui kromosomissa 9 sijaitsevaan SNP:hen rs81416363, kotieläimenä pidettävää sikaa varten. Paikansimme kotisika-spesifisen emäksen alukkeen 5′-päästä toiseksi viimeiseen emäkseen ja mismatch-emäksen 3′-päästä kolmanteen asemaan (alukkeen/koettimen järjestelmät Chr9v – x; lisätaulukko 1). Yhden epäsuhtaisen emäksen lisääminen ei kuitenkaan riittänyt kotisian ja villisian erottamiseen toisistaan. Epäsuhtaisten emästen lisääminen alukkeen 3. ja 5. kohtaan 3′-päästä (alukkeet/koetinjärjestelmät Chr9y – ag) johti ΔCt-arvoon ≥ 4,83. Kun mismatchit olivat paikoissa 3 ja 4 (alukkeet/koetinjärjestelmät Chr9ah – aj), ΔCt-arvo oli ≥ 5,85. Spesifisyyttä voitiin lisätä lisäämällä kolme peräkkäistä epäsuhtaista emästä alalajikohtaisen emäksen viereen (alukkeet/koetinjärjestelmät Chr9ak – am). Primer/anturijärjestelmä Chr9ak, jossa mismatchit olivat asemissa 3, 4 ja 5 (TTCATG → TGGTTG), johti korkeimpaan ΔCt-arvoon, joka oli ≥9,97. Näin ollen kaikki jatkokokeet tehtiin Chr9ak-aloitin/koetinjärjestelmällä. Jäljempänä kahta kromosomissa 9 sijaitsevaan SNP:hen rs81416363 kohdistuvaa singleplex-testiä kutsutaan nimellä assayChr9D, joka sisältää eteenpäin suuntautuvan alukkeen Chr9f8, käänteisen alukkeen Chr9r17D ja koettimen Chr9p2, ja assayChr9W, joka sisältää eteenpäin suuntautuvan alukkeen Chr9f8, käänteisen alukkeen Chr9r12W ja koettimen Chr9p2 (kuva 1B).

Alukkeen ja koettimen konsentraation ja suhteen optimointi

Kaikki edellä esitetyt tulokset saatiin alukkeen ja koettimen konsentraatioilla, jotka olivat 500 nM ja 200 nM (kromosomiin 1 kohdistuvat alukkeen ja koettimen järjestelmät) ja 200 nM ja 100 nM (kromosomeihin 5, 9 ja 13 kohdistuvat alukkeen ja koettimen järjestelmät). Seuraavaksi tutkittiin, voitaisiinko reaaliaikaisen PCR-määrityksen spesifisyyttä lisätä optimoimalla alukkeen ja koettimen pitoisuus ja suhde. AssayChr1:n tapauksessa optimaaliset alukkeen ja koettimen pitoisuudet olivat 1 000 nM ja 200 nM (lisätaulukko 4). AssayChr9W:n ja assayChr9D:n tapauksessa sekä alalajispesifistä emästä että mismatch-emäksiä sisältävän alukkeen ylijäämä johti suurempiin ΔCt-arvoihin ristireagoivan alalajin ja kohdelajin välillä. AssayChr9W:n ja assayChr9D:n korkein selektiivisyys saavutettiin, kun etummaisen alukkeen/vastakkaisen alukkeen/koettimen pitoisuudet olivat 12,5/200/50 nM ja 62,5/800/50 nM.

Ristireaktiivisuustestit

Seuraavaksi teimme ristireaktiivisuustestejä DNA-eristeiden kanssa, jotka olivat peräisin villisialta, erilaisista kotieläiminä pidetyistä sikaroduista/risteytyksistä ja 22 muusta lisätaulukossa 5 luetellusta eläinlajista. Kuvissa 2A-D esitetään assayChr9W:llä, assayChr9D:llä, assayChr1W:llä ja assayChr1D:llä saadut monistuskäyrät. AssayChr9W osoitti lievää ristireaktiivisuutta kotieläiminä pidettyjen sikojen, sikahirven, alppikauriin, lampaan, vuohen ja säämiskän kanssa (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D:n kanssa villisikojen, sikahirven, hirven, hevosen ja kalkkunan kanssa (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Toisin kuin kromosomissa 9 olevaan SNP:hen rs81416363 kohdistuvissa määrityksissä, assayChr1:ssä ei havaittu ristireaktiivisuutta (lukuun ottamatta assayChr1W:tä, joka koski metsäkauriita vain yhdessä neljästä toistosta). Analysoimme myös DNA-isolaatteja 50 kasvilajista, joita käytetään yleisesti elintarvikkeiden ainesosina (lisätaulukko 6). Yhdessäkään määrityksessä ei havaittu ristireaktiivisuutta minkään kasvilajin kanssa.

Tulokset, jotka saatiin suorittamalla ristireaktiivisuustestejä 22 eläinlajin ja villisian/kotieläimen DNA-isolaateilla (10 ng/µl). (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W ja (D) assayChr1D.

Erilaisten kaupallisten master-sekoitusten soveltuvuuden seulominen

Seuloimme seuraavassa koesarjassa, vaikuttaako kaupallisen master-sekoituksen tyyppi määritysten selektiivisyyteen. Analysoimme DNA-isolaatteja 23 eläinlajista, mukaan lukien 3 villisikayksilöä ja 11 kotieläimenä pidettävän sian rotua/risteytystä, yhteensä viidellä eri toimittajien master mixillä. Master mixit ja vastaavat lämpötilaohjelmat on esitetty lisätaulukossa 7. Yleisesti ottaen master mixin tyyppi vaikutti sekä absoluuttisiin Ct-arvoihin että ΔCt-arvoihin kohde- ja ristireagoivien (ali)lajien välillä. Reaaliaikaiset PCR-määritykset vaikuttivat kuitenkin eri tavoin. Esimerkiksi määrityksessäChr9W sekoitukset 2 ja 3 antoivat korkeammat Ct-arvot kuin master mix 1 (tässä tutkimuksessa käytetty standard master mix), 4 ja 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). AssayChr9D:n tapauksessa master mixin tyyppi vaikutti ΔCt-arvoihin ja siten määrityksen selektiivisyyteen. Master mix 1:llä, 2:lla, 3:lla ja 4:llä saadut ΔCt-arvot olivat vastaavasti ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 ja ≥ 5,86, kun taas master mix 5:llä ristireaktiivisuutta ei havaittu lainkaan. AssayChr1:n osalta saatiin melko samanlaiset Ct-arvot master mix 1:llä, 3:lla ja 4:llä. Master mix 2:lla ja 5:llä ei kuitenkaan muodostunut yhtään tuotetta, mikä johtuu todennäköisesti siitä, että nämä sekoitukset eivät sovellu multipleksointiin. Näiden havaintojen perusteella suosittelemme lämpimästi soveltuvuuden testaamista, jos on tarkoitus käyttää toisenlaista master mixiä.

Varmuus

Reaaliaikaisen PCR:n määritysten kestävyyttä tutkittiin vaihtelemalla hehkutuslämpötilaa ±1 °C ja reaktioseoksen tilavuutta kuoppaa kohti ±5 % ja käyttämällä kahta erilaista reaaliaikaisen PCR:n syklaria. Kokeet suoritettiin villisian, kotieläimenä pidettävän sian ja metsäkauriin DNA-isolaateilla. AssayChr9W:n ja assayChr9D:n Ct-arvot olivat hyvin samankaltaisia kuin vakio-olosuhteissa saadut arvot (ΔCt-arvot <1,00), paitsi kun hehkutuslämpötila nostettiin 61 °C:een (ΔCt-arvot ≤2,16 ja ≤1,57). Kun ΔCt-arvot olivat ≤0,77, assayChr1 osoittautui vielä kestävämmäksi. Kokonaisreaktiotilavuuden pienentäminen tai toisen reaaliaikaisen PCR-syklereiden käyttö ei vaikuttanut merkittävästi Ct-arvoihin, mikä osoittaa reaaliaikaisten PCR-määritysten kestävyyttä.

Työskentelyalue, lineaarinen alue ja monistustehokkuus

Analysoimalla villisian DNA-isolaattia (211 µg/ml) ja kahta kotieläimenä pidettävän sian DNA-isolaattia (158 µg/ml ja 160 µg/ml), jotka oli laimennettu sarjaan vedellä (1:2-1:524,288), assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W ja assayChr1D olivat lineaarisia välillä 211 µg/ml ja 13 ng/ml (R2 = 0.9948), 158 µg/ml ja 10 ng/ml (R2 = 0,9981), 211 µg/ml ja 6 ng/ml (R2 = 0,9994) ja 160 µg/ml ja 10 ng/ml (R2 = 0,9988) välillä (kuva 3A). Standardikäyrien kaltevuuden perusteella lasketut monistustehokkuudet olivat vastaavasti 83 %, 96 %, 93 % ja 95 %. Lisäksi lineaarisuuden vaihteluväli arvioitiin analysoimalla villisikojen ja kotieläimenä pidettävien sikojen DNA-isolaatteja, jotka oli laimennettu sarjaan silakan sperma-DNA:lla. AssayChr9W:n ja assayChr9D:n lineaarisuus vaihteli välillä 20 µg/ml-20 ng/ml (R2 = 0,9988) ja 20 µg/ml-39 ng/ml (R2 = 0,9985) (kuva 3B). AssayChr1W:n ja assayChr1D:n lineaarisuus oli välillä 20 µg/ml-5 ng/ml (R2 = 0,9978) ja 20 µg/ml-10 ng/ml (R2 = 0,9988). Standardikäyrien kaltevuuden perusteella lasketut amplifikaatiotehokkuudet olivat vastaavasti 76 %, 90 %, 97 % ja 101 %.

Neljän määrityksen lineaarisuuden vaihteluväli, (A) määritetty vedestä taustana ja (B) määritetty silakan siittiöiden DNA:lla muuna kuin kohdeaineena olevana tausta-DNA:na.

Nämä tulokset osoittavat, että reaaliaikaisten PCR-määritysten työalue on lähes identtinen, kun taas kromosomiin 9 kohdistuvien määritysten lineaarisuusalue on kapeampi kuin kromosomiin 1 kohdistuvien määritysten. Kaikki amplifikaatiotehokkuudet olivat 90-110 prosenttia, kuten ENGL:n ohjeissa17 suositellaan, lukuun ottamatta määritystäChr9W (83 prosenttia vedessä, 76 prosenttia silakan siittiöiden DNA:ssa). AssayChr9W:n alhaisempi amplifikaatiotehokkuus johtuu todennäköisesti alukkeen heikentyneestä sitoutumisstabiliteetista, joka johtuu mismatcheista, jotka on lisätty kohde-eläinlajin selektiivisyyden lisäämiseksi.

Havaitsemisraja (LOD) silakan sperma-DNA:lla ja sian DNA:lla tausta-DNA:na

LOD määriteltiin pienimmäksi DNA-konsentraatioksi, joka johti fluoresenssisignaalin kasvuun vähintään 19:ssä 20:stä toistokerrasta. Lisäksi Ct-arvon tulisi olla ristireagoiville lajeille saadun Ct-arvon alapuolella.

Silakan siemennesteen DNA:n osalta assayChr9D:n LOD (1,0 %, w/w, kuva. 4A) oli hieman korkeampi kuin kolmen muun määrityksen LOD (0,2 %, w/w, kuva 4B-D). MäärityksenChr9D korkeampi LOD-arvo johtuu ristireaktiivisuudesta villisian kanssa (ΔCt-arvo villisian ja kotisian välillä vain ≥8,41).

LOD:n määrittäminen analysoimalla sarjalaimennoksia (A-D) DNA-seoksista, jotka sisälsivät villisika- tai kotieläinsiika-DNA:ta silakan siittiö-DNA:ssa, ja (E-H) DNA-seoksesta, joka sisälsi taustatasona taustatasona olevaa villisika-DNA:ta kotieläinsija kotieläinsiika-DNA:ssa tai kotieläinsiika-DNA:ta villisika-DNA:ssa. (A,E) saatiin käyttämällä assayChr9D:tä, (B,F) käyttämällä assayChr9W:tä, (C,G) käyttämällä assayChr1D:tä ja (D,H) käyttämällä assayChr1W:tä. Mittaukset tehtiin 20 toistossa. Ympyrät kuvaavat yksittäisiä Ct-arvoja, vaakasuorat viivat kuvaavat keskiarvoja.

Määritimme lisäksi reaaliaikaisen PCR-määrityksen LOD-arvon villisian, assayChr1W ja assayChr9W, kohdalla, jossa taustana oli kotieläimenä pidettävän porsaan DNA, ja sen LOD-arvon kotieläimenä pidettävän porsaan, assayChr1D ja assayChr9D, kohdalla, jossa taustana oli luonnonvaraisen porsaan DNA. AssayChr9D:n (kuva 4E), assayChr9W:n (kuva 4F), assayChr1D:n (kuva 4G) ja assayChr1W:n (kuva 4H) LOD-arvot olivat melko erilaiset, kun käytettiin 2 %, 0,2 %, 5 % ja 2 % (w/w). AssayChr1D:n korkeampi LOD-arvo villisian DNA:n läsnä ollessa johtui signaalin suppressiosta, joka todennäköisesti johtui kahden koettimen kilpailusta kohdesekvenssistä dupleksitutkimusformaatissa. Signaalin tukahduttamisen tutkimiseksi tarkemmin analysoitiin DNA-seoksia, jotka sisälsivät joko 25 % (w/w) villisika-DNA:ta ja kotieläin-sika-DNA:ta tai 25 % (w/w) kotieläin-sika-DNA:ta ja villisika-DNA:ta, sekä positiivisia kontrolleja (vastaavasti villisika-DNA:ta ja kotieläin-sika-DNA:ta).

Vertaillessamme positiivisia kontrolleja 1:4 laimennettuihin standardeihin, jotka sisälsivät ei-kohde-DNA:ta, emme havainneet eroa amplifikaatiokäyrissä (ΔRn-arvoissa) assayChr9W:n ja assayChr9D:n osalta (Kuva 5A,B). AssayChr1W:n ja assayChr1D:n tapauksessa positiivisesta kontrollista saadut fluoresenssisignaalit (ΔRn-arvot) olivat kuitenkin suurempia kuin 1:4 laimennetusta standardista saadut fluoresenssisignaalit samalla kohde-DNA:n konsentraatiolla (kuvat 5C,D).

Amplifikaatiokäyrät (puoliksi logaritmisessa näkymässä), jotka on saatu DNA-seoksille (20 ng/µl), jotka sisälsivät 25 % (w/w) kohdelajin alalajia (villisika tai kotieläimenä pidetty sika) ja 75 % (w/w) muuta kuin kohdealalajin alalajia (villisika tai kotieläimenä pidetty sika), sekä niiden sarjalaimennoksille (1:4 – 1:1,024). Kontrolleina käytettiin DNA-isolaatteja (5 ng/µl) villisioista ja kotisioista. AssayChr9W (A) ja assayChr9D (B) osoittavat ristireaktiivisuutta muiden kuin kohdealalajien kanssa. AssayChr1W (C) ja assayChr1D (D) osoittavat signaalin suppressiota muiden kuin kohdealalajien läsnä ollessa.

Koistettavuus

Reaaliaikaisten PCR-määritysten toistettavuutta tutkittiin analysoimalla lihauuteseoksia, jotka sisälsivät 30 % (w/w) kohde-DNA:ta (target DNA:ta) ja 70 % (w/w) muiden kuin kohdealalajien DNA:ta (non-kohde DNA:ta) sekä niiden sarjalaimennoksia, kahtena eri määrityskertana viitenä päivänä neljästi. Ct-arvojen RSD oli ≤1,0 % (assayChr1W), ≤1,9 % (assayChr9W), ≤2,3 % (assayChr1D) ja ≤3,5 % (assayChr9D), mikä osoittaa määritysten hyvän toistettavuuden.

Villisika- ja kotieläinsikayksilöiden näytteiden analysointi

Reaaliaikaisia PCR-määrityksiä sovellettiin 64 kotieläinsikayksilön näytteiden analysointiin, mukaan lukien 14 rotua ja 6 risteytystä (kuva 6A). Lisäksi analysoimme yhteensä 30 villisianäytettä viidestä eri maasta (Itävallasta, Virosta, Saksasta, Romaniasta ja Yhdysvalloista, kuva 6B). Yhden Euroopasta peräisin olevan villisikayksilön tarkka alkuperä ei ollut tiedossa. Jokainen näyte analysoitiin vähintään neljänä toistona. Jokaiseen PCR-levyyn lisättiin positiivinen kontrolli (DNA-seos, 10 ng/µl), joka sisälsi kohdealalajia samassa pitoisuudessa kuin LOD, jolloin saatiin cut-off Ct-arvo.

Tulokset, jotka saatiin seuraavista näytteistä: A) 64 kotieläimenä pidettävää sianäytettä (A) ja 30 villisianäytettä (B). Mittaukset tehtiin vähintään neljässä toistossa.

Kun analysoimme positiivisia kontrolleja 14 toistossa, Ct-arvojen keskiarvo ± SD oli 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) ja 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). AssayChr9D:tä lukuun ottamatta kaikkia näytteitä, joiden Ct-arvot olivat korkeammat, pidettiin <LOD. AssayChr9D:n tapauksessa useiden villisikanäytteiden Ct-arvot olivat ≥ 34,61. Väärien positiivisten tulosten todennäköisyyden pienentämiseksi assayChr9D:n Ct-raja-arvoksi asetettiin 34,00. Sovellettaessa assayChr9W- ja assayChr9D-analyysejä rutiinianalyyseihin suosittelemme käyttämään positiivista kontrollia, joka koostuu 2 % (w/w) kotieläimenä pidettävän sian DNA:sta, 0,2 % (w/w) villisian DNA:sta ja 97,8 % (w/w) silakan siittiöiden DNA:sta.

Kotieläimenä pidettävien sianäytteiden analysoinnissa assayChr9D-analyysin avulla saimme 63 positiivista ja vain yhden negatiivisen tuloksen (Mangalica 1) (kuva 6). Analysoimme 12 Cinta Senese -yksilöstä kaksi erilaista lihan osaa, vähärasvaisen näytteen (longissimus dorsi -lihasta) ja ihonalaisen selän rasvanäytteen (selkäfileestä) (tietoja ei ole esitetty). Vähärasvaisista näytteistä saadut Ct-arvot (Ct-keskiarvo ± SD 25,24 ± 0,44, n = 48) olivat hyvin samankaltaisia kuin ihonalaisista selän rasvanäytteistä saadut arvot (26,29 ± 0,35, n = 48). Kun analysoimme 30 villisikanäytettä assayChr9D:llä, 21:ssä näytteessä fluoresenssisignaali ei lisääntynyt, mutta yhdeksän yksilöä (yksi Itävallasta, viisi Saksasta ja kolme Yhdysvalloista) tunnistettiin kotisioiksi.

AssayChr9W:llä suurin osa villisikanäytteistä määritettiin oikein, vain kolmesta näytteestä (yksi Saksasta ja kaksi Yhdysvalloista) saatiin negatiiviset tulokset. AssayChr9W:n avulla saatiin kuitenkin positiivisia tuloksia myös joidenkin kotieläinsikayksilöiden osalta, mukaan lukien yksi Bentheim Black Pied, kolme Krškopolje- ja kolme Mangalica-sikaa. Erityisesti kolme Itävallasta peräisin olevaa Mangalica-sikaa tunnistettiin kotisioiksi, kun taas kolme Saksasta peräisin olevaa yksilöä tunnistettiin villisioiksi. AssayChr9:n osalta, mukaan lukien assayChr9W ja assayChr9D, 94:stä lihanäytteestä 12 johti epäselviin tuloksiin, koska fluoresenssisignaali kasvoi molemmilla reaaliaikaisilla PCR-määrityksillä. Lisäksi yksi Mangalica-sikayksilö tunnistettiin villisialle ja kolme villisikayksilöä kotisialle.

Beuginin ym.11 tutkimuksessa SNP rs81416363:n soveltuvuutta oli testattu ”puhtailla” villisioilla, joita metsästettiin luonnonsuojelualueella Vosgesissa Ranskassa, sekä rajoitetulla määrällä kaupallisia sianrotuja (Landrace, Large White, Piétrain ja Duroc). Villisikojen todettiin kantavan G-alleelia (frekvenssi 100 %, ei heterotsygoottiutta), kotieläiminä pidettyjen sikojen A-alleelia (frekvenssi 98 %, heterotsygoottius 5 %).

Voidaksemme selvittää, miksi assayChr9W- ja assayChr9D-analyysit johtivat useisiin virheellisiin luokituksiin ja joihinkin epäselviin tuloksiin, genotyypöimme vastaavien villisikojen ja kotieläiminä pidettävien sikojen näytteistä korkearesoluutioisen sulatusanalyysin avulla. Käytimme HRM-analyysiä, koska se on tehokas, aika- ja kustannustehokas tekniikka SNP-genotyypin määrittämiseen18. Normalisoidut sulamiskäyrät (kuva 7A) osoittavat, että homotsygoottista G-genotyyppiä ei löytynyt ainoastaan villisianäytteistä, vaan myös Mangalica-näytteestä (näyte 1), jonka fluoresenssisignaalin kasvu saatiin assayChr9W:llä mutta ei assayChr9D:llä. Villisikanäytteissä, joiden fluoresenssisignaali lisääntyi assayChr9D:llä, todettiin olevan vähintään yksi kopio A-alleelia. Neljä villisikayksilöä osoitti heterotsygoottista genotyyppiä, viisi oli homotsygoottisia A-alleelin suhteen. Lisäksi viidellä kotieläiminä pidetyllä sikayksilöllä, mukaan luettuna kolme Sloveniasta peräisin olevaa Krškopolje-yksilöä, todettiin olevan sekä A- että G-alleeli. Näin ollen HRM-genotyypin määrityksen avulla voitiin varmistaa, että assayChr9W:llä ja assayChr9D:llä saadut tulokset vastasivat yksilöiden genotyyppejä. Tuloksemme osoittavat kuitenkin, että SNP rs81416363:een kohdistuvat kaksi singleplex-määritystä, assayChr9W ja assayChr9D, eivät mahdollista villisikojen ja kotieläimenä pidettävien sikojen yksiselitteistä erottelua.

Normalisoidut HRM-käyrät seuraaville testeille: A) SNP:n rs81614363:lle (g.118314929 A > G) kromosomissa 9 homotsygoottiselle G:lle (villisika), homotsygoottiselle A:lle (kotieläimenä pidetty sika) ja heterotsygoottiselle A + G:lle ja (B) SNP g.299084751 C > T kromosomissa 1 homotsygoottiselle C:lle (villisika), homotsygoottiselle T:lle (kotisika) ja heterotsygoottiselle C + T:lle.

AssayChr1D:llä kaikki kotisikunäytteet kolmea lukuun ottamatta luokiteltiin kotisikunäytteiksi (kuva 6). AssayChr9D:n mukaisesti Ct-arvot, jotka saatiin 12 Cinta Senese -yksilön vähärasvaisista näytteistä ja ihonalaisesta selän rasvanäytteistä, olivat hyvin samankaltaisia (Ct-arvojen keskiarvo ± SD 25,99 ± 0,25 (n = 48) ja 26,36 ± 0,25 (n = 48)). AssayChr1D:n avulla myös viisi 30 villisikanäytteestä tunnistettiin kuitenkin kotisioiksi. Villisikanäytteiden analysointi assayChr1W:llä johti vain yhteen negatiiviseen tulokseen. Kuitenkin myös yksi Mangalica-näyte ja kuusi Turopolje-yksilöä johtivat fluoresenssisignaalin lisääntymiseen assayChr1W:llä.

Fontanesi ym.10:n tutkimuksessa SNP g.299084751. C > T oli genotyypitetty analysoimalla näytteitä 293 kotieläimenä pidetystä sianlihasta, jotka kuuluivat viiteen kaupalliseen rotuun (italialainen Large White, italialainen maatiaisrotu, italialainen duroc, belgialainen maatiaisrotu ja Piétrain), sekä 201 villisian näytteistä, jotka olivat peräisin eteläisestä Keski-Euroopasta (Pohjois-Italiasta) ja eteläisestä Itä-Euroopasta (Sloveniasta ja Länsi-Balkanin alueilta). Fontanesi et al. havaitsivat, että kaikki kotisikayksilöt olivat homotsygoottisia T-alleelin suhteen. 7,5 prosentilla villisikayksilöistä oli vähintään yksi T-alleelin kopio, ja Kaakkois-Euroopasta peräisin olevilla yksilöillä oli useammin T-alleeli (12,2 %) kuin Etelä-Keski-Euroopasta peräisin olevilla yksilöillä (3,6 %). Kaakkois-Euroopan villisioista 11,1 %:lla oli heterotsygoottinen C/T-genotyyppi.

Kun genotyypitimme villisika- ja kotieläinsikayksilöt SNP:n g.299084751 C > T osalta HRM-analyysin avulla, havaitsimme T-alleelin kotieläinsikojen lisäksi myös joillakin villisioilla (kuva 7B). Yhdysvalloista peräisin olevalla villisikayksilöllä oli homotsygoottinen T-genotyyppi, kun taas Ala-Itävallasta peräisin olevalla villisikayksilöllä oli sekä C- että T-alleeli. Suurin osa villisikayksilöistä oli kuitenkin homotsygoottisia C-alleelin suhteen. Tämä tulos osoittaa, että kolmen villisikanäytteen (Saksa Bad Kissingen ja Perleberg sekä Eurooppa) fluoresenssisignaalin lisääntyminen, joka saatiin assayChr1D:llä, ei ollut niiden genotyypin mukaista ja johtui siten ristireaktiivisuudesta. Suurin osa kotisikayksilöistä oli homotsygoottisia T-alleelin suhteen. Kahdeksasta Turopolje-yksilöstä kuudella havaittiin kuitenkin heterotsygoottinen C/T-genotyyppi, mikä selittää sen, miksi fluoresenssisignaali kasvoi sekä assayChr1D- että assayChr1W-testillä. Heterotsygoottisen C/T-genotyypin suuri esiintyvyys Kroatiasta peräisin olevassa kotieläimenä pidetyssä Turopolje-rotuisessa sianrotuisessa eläimessä vastaa Fontanesi-tutkimusryhmän hiljattain julkaisemaa artikkelia. Genotyypittämällä 47 Turopolje-yksilöä T- ja C-alleelin frekvenssin raportoitiin olevan 0,57 ja 0,4319.

Tuloksemme osoittavat, etteivät SNP:hen rs81416363 kohdistuvat kaksi singleplex-määritystä eivätkä SNP:hen g.299084751 C > T kohdistuva duplex-määritys yksinään mahdollista villisikojen ja kotieläimenä pidettävän porsaan yksiselitteistä erottelua. Kun kuitenkin otetaan huomioon kahden singleplex-määrityksen ja duplex-määrityksen tulokset, erottelukykyä voidaan lisätä huomattavasti. Tuloksemme osoittavat, että jos saman alalajin kaksi määritystä (esim. assayChr9D ja assayChr1D) johtavat identtiseen luokitteluun (annetussa esimerkissä kotisika) ja toisen alalajin kahdella määrityksellä saadut tulokset (annetussa esimerkissä assayChr9W ja assayChr1W) ovat epäselviä, vääränlaisen luokittelun todennäköisyys on vähäinen, jos luotetaan identtisiin tuloksiin. Tätä strategiaa noudattaen 94 yksilöstä 86 (91,5 %) voitiin määrittää oikein.