Pathogénie In Vitro
Les cellules épithéliales colonnaires sont des cellules cul-de-sac qui connaissent deux extrêmes de pH à la fois. Apicalement, elles baignent dans les fluides intestinaux hautement alcalins et basalement, elles baignent dans l’hémolymphe légèrement acide. Ces conditions sont difficiles à imiter en culture cellulaire, ce qui peut expliquer le peu d’informations disponibles sur l’infection primaire.
Les lignées cellulaires qui supportent la réplication du GV sont rares et n’existent actuellement que pour le CpGV. Par conséquent, nous n’en savons guère plus sur les mécanismes de l’infection par le GV que sur l’infection par l’ODV. Malgré cela, nous savons que pendant la morphogenèse de la nucléocapside du GV, la membrane nucléaire de la cellule hôte se désintègre, un événement qui ne perturbe pas la transformation de la nucléocapside. La disparition de la membrane nucléaire est distinctive et ne se produit pas dans les cellules hôtes infectées par le NPV.
On a établi un certain nombre de lignées cellulaires d’insectes qui supportent les infections par le NPV. La plupart de ces lignées cellulaires sont dérivées d’ovaires ou d’embryons de chenilles. L’AcMNPV peut se répliquer dans des lignées cellulaires dérivées de plusieurs espèces d’insectes, ce qui contribue à en faire le baculovirus le mieux étudié. Dans une courbe de croissance standard en une étape, les BV de l’AcMNPV sont généralement produits 12 à 20 h après l’infection (hpi), et les occlusions, 20 à 48 hpi. La réplication de la plupart des autres NPV en culture cellulaire prend des heures à des jours de plus.
L’AcMNPV BV est 1000 fois plus infectieux que l’ODV, principalement en raison de la présence de sa protéine de fusion, GP64. Les BV pénètrent dans leurs cellules cibles par endocytose médiée par la clathrine. Les nucléocapsides BV pénètrent profondément dans le cytoplasme des cellules cibles en étant libérées des endosomes. Grâce à cette stratégie, les nucléocapsides contournent l’environnement potentiellement dangereux qui se trouve juste sous la membrane plasmique et pénètrent dans la cellule plus près du noyau que ne le permettrait la fusion au niveau de la membrane plasmique. Les changements de conformation sensibles au pH subis par les protéines de fusion BV servent à déclencher un événement de fusion entre l’enveloppe virale et la membrane endosomale.
L’échappement de la nucléocapside d’AcMNPV de l’endosome est immédiatement suivi par son association avec les câbles de F-actine. La formation des câbles est transitoire, et se produit pendant le temps où les nucléocapsides virales se déplacent vers et entrent dans le noyau. Pendant le transit, les nucléocapsides virales se colocalisent avec une extrémité d’un câble d’actine, probablement par l’intermédiaire de P78/83, une protéine de liaison à la F-actine que l’on pense être située à la base des nucléocapsides. L’association des nucléocapsides avec les câbles de F-actine et le retard de l’expression du gène rapporteur en présence de médicaments qui perturbent la fonction de l’actine/myosine suggèrent que les câbles peuvent faciliter le transport des nucléocapsides vers le noyau, ou médier leur passage à travers les pores nucléaires.
Les nucléocapsides du PNV et de certains GV pénètrent dans les noyaux via les pores nucléaires. Certains GV se désenrobent au niveau des pores nucléaires mais la plupart des baculovirus se désenrobent à l’intérieur du noyau. La transcription des gènes précoces commence immédiatement, médiée par l’ARN polymérase II (Pol II) de l’hôte. Parmi les gènes précoces exprimés, on trouve un sous-ensemble dont l’expression entraîne un transport efficace de la G-actine vers le noyau et son accumulation dans celui-ci (figure 5). Cette manipulation spectaculaire de la localisation de l’actine est essentielle pour la production de la progéniture de NPV et n’a été décrite pour aucun autre pathogène. Les gènes impliqués dans la localisation nucléaire de l’actine, identifiés dans les expériences de transfection transitoire, comprennent ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 et Ac102. Deux de ces gènes, ie1 et Ac102, sont conservés parmi tous les NPV et GV de lépidoptères, et tous deux sont essentiels.
Figure 5. G-actine nucléaire dans les cellules infectées par l’AcMNPV. (a) Cellules infectées colorées au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ; (b) cellule infectée exprimant la protéine fluorescente verte (GFP)-actine transfectée. (c) L’absence de coloration nucléaire à la rhodamine-phalloïdine indique que l’actine nucléaire est monomérique.
Le passage au stade tardif de l’infection est le début de la période de production de la progéniture BV ; les activités cellulaires sont orientées vers la synthèse des composants viraux à des taux maximaux, leur assemblage en produits nucléocapsidiques, puis leur exportation. La synthèse macromoléculaire de l’hôte est arrêtée pendant cette période, mais la structure de la chromatine de l’hôte reste intacte jusqu’à la mort cellulaire. Les gènes viraux tardifs et très tardifs sont exprimés par une ARN polymérase codée par le virus.
Les microtubules, réorganisés pendant la phase précoce de l’infection, sont dépolymérisés par les facteurs produits pendant la phase tardive conduisant à l’arrondissement des cellules (Figure 6). De même, la G-actine, accumulée dans le noyau pendant la phase précoce, se polymérise pendant la phase tardive, simultanément au gonflement nucléaire et à la disparition des structures nucléaires visibles de l’hôte (Figure 7). Le stroma virogénique, site de synthèse de l’ADN viral, se forme au centre du noyau et est entrecoupé et entouré d’une zone transparente aux électrons appelée » zone annulaire « , lieu où les capsides sont assemblées et attachées pendant le chargement du génome. La F-actine nucléaire se colocalise avec la principale protéine de capside de l’AcMNPV dans la zone annulaire (Figure 7).
Figure 6. Cellules Sf21 infectées par AcMNPV démontrant différentes phases de l’effet cytopathique (ECP). (a) Cellules non infectées. Notez la forme fusiforme et la présence de structures de nucléochromatine. (b) Cellules infectées par AcMNPV présentant un ECP précoce et tardif. Les cellules sont arrondies en raison de la dépolymérisation des microtubules, les noyaux sont plus gros et débarrassés des structures de l’hôte, et le stroma virogénique (vs) est entouré d’une zone annulaire (rz). Les stromas virogéniques deviennent plus denses au fur et à mesure que le stade tardif de l’infection progresse. Les polyèdres remplissent le noyau pendant le stade très tardif de l’infection (p).
Figure 7. F-actine nucléaire dans la cellule infectée par AcMNPV pendant l’expression tardive du gène. (a) La coloration au DAPI indique la localisation du noyau. (b) La fluorescence verte indique que la protéine de capside est principalement localisée dans la zone annulaire du noyau. (c) La coloration à la phalloïdine rhodamine montre que la F-actine se colocalise avec la capside dans la zone annulaire.
La F-actine nucléaire est nécessaire à la production de BV. En présence de médicaments perturbant la F-actine, les capsides virales sont malformées et apparaissent comme de longues structures tubulaires juxtaposées à la membrane nucléaire interne avec des taches peu fréquentes de matériel dense en électrons. Les plaques de base et les structures de capside normalement présentes ne sont pas évidentes, et un excès de profils membranaires est produit. La synthèse de l’ADN viral se produit au rythme normal, mais les génomes ne sont pas empaquetés, et le stroma virogénique a un aspect » détendu » par rapport au stroma normal. Il est intéressant de noter que le phénotype de l’absence du facteur-1 très tardif (VLF-1) de l’AcMNPV est similaire, ce qui suggère que le VLF-1 peut être impliqué dans l’attachement des capsides au stroma virogénique, et que la F-actine est un composant du stroma auquel les capsides sont attachées, directement ou indirectement.
P78/83, une protéine de capside mineure exprimée tard au cours de l’infection, est essentielle pour la viabilité de l’AcMNPV. Cette caractéristique a été notée il y a plus de 30 ans et exploitée dans les premiers kits commerciaux d’expression de baculovirus. On pense que la protéine P78/83 (78 kDa lorsqu’elle n’est pas phosphorylée et 83 kDa lorsqu’elle est phosphorylée) fait partie des plaques de base des capsides BV et ODV. La P78/83 est une protéine de liaison à la F-actine, et cette activité peut aider à attacher les capsides à la matrice nucléaire pendant l’assemblage. Il est intéressant de noter que la protéine P78/83 présente une autre activité qui explique pourquoi elle est essentielle : elle favorise la polymérisation de l’actine dans le noyau. La protéine P78/83 contient des domaines conservés dans les membres de la famille des protéines du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), des facteurs qui favorisent la nucléation des filaments d’actine. Les membres de la famille WASP régulent positivement l’activité de nucléation de l’actine du complexe Actin Related Protein (Arp)-2/3. Le complexe à sept sous-unités, conservé chez les eucaryotes, est transloqué vers le noyau dans les cellules infectées par le virus AcMNPV et est activé par P78/83. Les mutations de P78/83 qui entraînent une diminution de la capacité à promouvoir la nucléation de l’actine entraînent de manière correspondante une diminution de la capacité à produire des BV infectieux.
Dès son entrée dans le noyau, l’ADN de l’AcMNPV adopte une structure de type nucléosomique et utilise les nucléosomes et les processus liés aux nucléosomes dans la réplication du génome. Un élément de la stratégie de réplication virale semble donc détourner des composants, sinon la totalité, de la capacité de remodelage de la chromatine de l’hôte. Des preuves récentes suggèrent que les protéines de la famille BRO (baculovirus repeated orf) participent probablement à ce processus. Les protéines BRO sont exprimées au début de l’infection, se lient à l’ADN simple brin (ADNs) et aux histones centrales, et se séparent avec les histones dans les expériences de fractionnement. Le BmNPV, l’orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, et le lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus ont tous plusieurs gènes bro. L’AcMNPV ne porte qu’un seul gène bro, apparenté au bro-d du BmNPV, qui est essentiel.
La protéine P6.9 codée par l’AcMNPV, la protéine d’empaquetage du génome hautement basique, commence à s’accumuler pendant le stade tardif de l’infection et une structure chromatinienne alternative émerge.
Les interactions P6.9-ADN sont contrôlées par l’état de phosphorylation de P6.9. Au cours de l’empaquetage du génome, l’ADN génomique provenant du stroma virogénique se lie à P6.9 alors que P6.9 est déphosphorylé, se condensant en une gaine de capside préformée à travers une ouverture dans une structure d’extrémité conique. Les structures coniques se trouvent à proximité du stroma virogénique, les gaines de capside étant recouvertes par des plaques de base s’étendant distalement dans un espace moins dense en électrons, la zone annulaire. La F-actine et la protéine de capside sont co-localisées dans la zone annulaire, ainsi que la P78/83 et le complexe Arp2/3. C’est cette étape de la réplication qui est affectée à la fois par les médicaments qui perturbent la F-actine et par l’absence de VLF-1.
Avec le début de la phase très tardive de l’infection, il y a une réduction de la production de BV et il y a un début de production de ODV. Les nucléocapsides nouvellement assemblées restent dans le noyau où elles sont enveloppées dans des enveloppes que l’on pense être dérivées de la membrane nucléaire interne. Les virions enveloppés, mais pas les nucléocapsides non enveloppés, s’occluent dans une matrice protéique pour former des capsules ou des polyèdres. Les cellules finissent par se lyser, libérant les occlusions dans le milieu.