Différenciation entre le sanglier et le porc domestique dans l’alimentation en ciblant deux loci génétiques par PCR en temps réel

Conception des amorces et des sondes

Pour la conception des amorces et des sondes, nous avons sélectionné des polymorphismes qui avaient déjà été rapportés pour permettre la discrimination du sanglier et du porc domestique. Nous avons commencé par le SNP g.299084751 C > T dans le gène NR6A1, qui a été trouvé associé au nombre de vertèbres thoraciques et lombaires : les sangliers, qui sont homozygotes pour l’allèle sauvage g.299084751 C, ont 19 vertèbres, alors que les porcs domestiques, qui sont homozygotes pour g.299084751 T, ont 21-23 vertèbres. Dans l’étude de Fontanesi et al. ce SNP a été utilisé pour discriminer le sanglier et le porc domestique par PCR-RFLP10. Nous avons voulu concevoir une paire d’amorces pour l’amplification de la région cible chez le sanglier et le porc domestique, et deux sondes TaqMan, spécifiques de l’allèle du sanglier (g.299084751 C) et de l’allèle du porc domestique (g.299084751 T), respectivement. Le test duplex devrait permettre de détecter simultanément le sanglier et le porc domestique dans un seul et même puits. Au total, nous avons conçu quatre amorces directes, trois amorces inverses, quatre sondes de sanglier et une sonde de porc domestique et nous les avons combinées en 21 systèmes d’amorces/sondes (Chr1a – u, Tableau supplémentaire 1). Le système d’amorces/sondes Chr1a ciblait le brin supérieur, les systèmes d’amorces/sondes Chr1b-u le brin inférieur du gène NR6A1. Dans une série d’expériences, nous avons cherché à savoir si les systèmes d’amorces/sondes étaient spécifiques du sanglier ou s’ils présentaient une réactivité croisée avec des races de porcs domestiques/des croisements. Le système d’amorces/sondes Chr1a a donné lieu à une valeur ΔCt ≥ 10,56 entre le porc domestique et le sanglier (tableau supplémentaire 2). Pour les systèmes d’amorces/sondes Chr1i – o, les valeurs ΔCt étaient comprises entre 8,65 et 11,19. Les systèmes d’amorces/sondes Chr1b – h et Chr1p – t n’ont pas entraîné d’augmentation du signal de fluorescence pour les races/croisements de porcs domestiques. Étant donné que le système d’amorces/sondes Chr1q a donné lieu à la valeur Ct la plus faible (24,77 ; n = 2) pour le sanglier, nous avons testé son applicabilité en combinaison avec une sonde TaqMan pour le porc domestique dans le format de test duplex (système d’amorces/sondes Chr1u, tableau supplémentaire 1). Les valeurs de Ct pour le sanglier (26,21, n = 2) et le porc domestique (27,90, n = 2) étant satisfaisantes, toutes les autres expériences de PCR ciblant le SNP g.299084751 C > T ont été réalisées avec le système amorce/sonde Chr1u. Dans ce qui suit, l’essai PCR en temps réel duplex est appelé assayChr1, composé de l’essai pour le porc domestique, assayChr1D, impliquant l’amorce directe Chr1f4, l’amorce inverse Chr1r2 et la sonde Chr1p1D, et l’essai pour le sanglier, assayChr1W, impliquant l’amorce directe Chr1f4, l’amorce inverse Chr1r2 et la sonde Chr1p4W (Fig. 1A).

Séquences partielles de (A) le gène NR6A1 sur le chromosome 1 portant le SNP g.299084751. C > T, ciblé par le test duplex « assayChr1 », et (B) du chromosome 9 portant le SNP g.118314929 A > G (rs81416363), ciblé par les deux tests singleplex « assayChr9D » et « assayChr9W ». Les flèches indiquent les positions des amorces (en gris foncé) et des sondes (en gris clair). (A) L’essai en duplexChr1 comprenait l’amorce directe Chr1f4, l’amorce inverse Chr1r2, la sonde Chr1p4W et la sonde Chr1p1D. (B) Le test simplexChr9D comprenait l’amorce directe Chr9f8, l’amorce inverse Chr9r17D et la sonde Chr9p2 ; le test simplexChr9W comprenait l’amorce directe Chr9f8, l’amorce inverse Chr9r12W et la sonde Chr9p2. Les bases spécifiques aux sous-espèces sont indiquées en gras (flèches rouges verticales) et les bases de mésappariement en bleu (flèches bleues verticales).

Puisque nous avions appris dans la littérature que le pouvoir de discrimination en ciblant un seul polymorphisme est très probablement insuffisant, nous avons cherché un autre locus génétique approprié. En étudiant 20 SNP pour leur applicabilité à différencier le sanglier du porc domestique, Beugin et al. avaient trouvé que les SNP rs80864596 (intergénique, chromosome 5), rs80796712 (glycogène synthase kinase 3-beta, chromosome 13) et rs81416363 (intergénique, chromosome 9) montraient le plus haut pouvoir de discrimination11. Nous avons donc sélectionné ces trois SNP pour concevoir des systèmes d’amorces/sondes. Par rapport à la conception d’amorce/sonde pour le SNP g.299084751 C > T, nous avons poursuivi une stratégie différente. Au lieu de localiser la base spécifique à la sous-espèce dans la sonde, nous l’avons localisée à l’avant-dernier site de l’extrémité 5′ de l’amorce avant ou arrière. Afin d’améliorer la spécificité, nous avons introduit des mésappariements de base délibérés. Cette technique dite d’essai de mutation par amplification des mésappariements (MAMA)12,13 présente l’avantage d’être plutôt rentable car une seule et même sonde peut être testée avec un certain nombre d’amorces différant par la position du mésappariement. Dans la première série d’expériences, nous avons introduit la base mismatch soit à la 3ème ou à la 6ème position à partir de l’extrémité 3′ de l’amorce portant la base spécifique de la sous-espèce. Lorsque nous avions développé des tests PCR en temps réel pour le cerf rouge, le daim et le cerf sika, respectivement14,15,16, cette stratégie s’était avérée fructueuse. Cependant, dans la présente étude, aucun des systèmes d’amorces/sondes (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Tableau supplémentaire 1) n’a permis de différencier le porc domestique du sanglier (Tableau supplémentaire 3). Les meilleurs résultats (valeur ΔCt entre les races/croisements de porc domestique et le sanglier ≥5,24) ont été obtenus avec le système amorce/sonde Chr9j. Dans ce système amorce/sonde, ciblant le SNP rs81416363 sur le chromosome 9, la base de mésappariement était située en 3e position à partir de l’extrémité 3′ de l’amorce (TTCACG → TTCCCG). Afin d’augmenter la spécificité, nous avons introduit un mismatch supplémentaire en 4ème (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) ou 5ème position (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) à partir de l’extrémité 3′ de l’amorce. L’introduction de mésappariements supplémentaires s’est avérée être un succès. Avec le système amorce/sonde Chr9r (tableau supplémentaire 1), nous avons obtenu à la fois la valeur Ct la plus faible pour le sanglier (22,09 ; n = 2) et la valeur ΔCt la plus élevée (10,52) entre les races/croisements de porcs domestiques et le sanglier (tableau supplémentaire 3). Ce test PCR en temps réel pour le sanglier, ciblant le SNP rs81416363 situé sur le chromosome 9, était basé sur le système amorce/sonde Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Puis, nous avons appliqué la stratégie MAMA pour développer le test PCR en temps réel correspondant, ciblant le SNP rs81416363 situé sur le chromosome 9, pour le porc domestique. Nous avons localisé la base spécifique au porc domestique à l’avant-dernière base de l’extrémité 5′ de l’amorce et la base mismatch à la 3e position de l’extrémité 3′ (systèmes amorce/sonde Chr9v – x ; tableau supplémentaire 1). Cependant, l’introduction d’une base mismatch n’était pas suffisante pour permettre la différenciation du porc domestique et du sanglier. L’introduction de bases mismatch en 3ème et 5ème position à partir de l’extrémité 3′ de l’amorce (systèmes amorce/sonde Chr9y – ag) a conduit à une valeur ΔCt ≥ 4,83. Lorsque les mésappariements se trouvaient aux positions 3 et 4 (systèmes amorce/sonde Chr9ah – aj), la valeur ΔCt était ≥5,85. En introduisant trois bases consécutives de mésappariement à côté de la base spécifique de la sous-espèce (systèmes d’amorces/sondes Chr9ak – am), la spécificité a pu être augmentée. Le système amorce/sonde Chr9ak, dans lequel les mésappariements se trouvaient en position 3, 4 et 5 (TTCATG → TGGTTG) a conduit à la valeur ΔCt la plus élevée de ≥9,97. Ainsi, toutes les expériences ultérieures ont été réalisées avec le système amorce/sonde Chr9ak. Dans ce qui suit, les deux essais en singleplex ciblant le SNP rs81416363 sur le chromosome 9 sont appelés essaiChr9D, comprenant l’amorce directe Chr9f8, l’amorce inverse Chr9r17D et la sonde Chr9p2, et essaiChr9W, comprenant l’amorce directe Chr9f8, l’amorce inverse Chr9r12W et la sonde Chr9p2 (figure 1B).

Optimisation de la concentration et du rapport amorce/sonde

Tous les résultats présentés ci-dessus ont été obtenus avec des concentrations d’amorce et de sonde de 500 nM et 200 nM (systèmes amorce/sonde ciblant le chromosome 1), et 200 nM et 100 nM (systèmes amorce/sonde ciblant les chromosomes 5, 9 et 13), respectivement. Ensuite, nous avons cherché à savoir si la spécificité des tests PCR en temps réel pouvait être augmentée en optimisant la concentration et le rapport amorce/sonde. Dans le cas du test Chr1, les concentrations optimales de l’amorce et de la sonde ont été trouvées à 1 000 nM et 200 nM, respectivement (tableau supplémentaire 4). Dans le cas des tests Chr9W et Chr9D, un surplus d’amorce portant à la fois la base spécifique à la sous-espèce et les bases de mésappariement a entraîné des valeurs ΔCt plus élevées entre la sous-espèce à réaction croisée et l’espèce cible. La sélectivité la plus élevée de l’essaiChr9W et de l’essaiChr9D a été obtenue avec des concentrations d’amorce avant/amorce inverse/sonde de 12,5/200/50 nM et 62,5/800/50 nM, respectivement.

Tests de réactivité croisée

Puis, nous avons effectué des tests de réactivité croisée avec des isolats d’ADN provenant de sangliers, de diverses races/croisements de porcs domestiques et de 22 autres espèces animales énumérées dans le tableau supplémentaire 5. Les figures 2A-D montrent les courbes d’amplification obtenues avec les tests assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W et assayChr1D, respectivement. Le dosageChr9W a montré une légère réactivité croisée avec les porcs domestiques, le cerf sika, le bouquetin alpin, le mouton, la chèvre et le chamois (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), le dosageChr9D avec les sangliers, le cerf sika, l’élan, le cheval et la dinde (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Contrairement aux tests ciblant le SNP rs81416363 sur le chromosome 9, l’assayChr1 n’a pas montré de réactivité croisée (à l’exception de l’assayChr1W pour le chevreuil dans seulement un réplicat sur quatre). Nous avons également analysé des isolats d’ADN provenant de 50 espèces végétales couramment utilisées comme ingrédients alimentaires (tableau supplémentaire 6). Aucun des essais n’a montré une réactivité croisée avec l’une des espèces végétales.

Résultats obtenus en effectuant des tests de réactivité croisée avec des isolats d’ADN (10 ng/µL) de 22 espèces animales et de sanglier/porc domestique. (A) essaiChr9W, (B) essaiChr9D, (C) essaiChr1W et (D) essaiChr1D.

Criblage de divers mélanges maîtres commerciaux pour leur applicabilité

Dans une série suivante d’expériences, nous avons cherché à savoir si le type de mélange maître commercial influençait la sélectivité des essais. Nous avons analysé les isolats d’ADN de 23 espèces animales, dont 3 individus de sanglier et 11 races/croisements de porc domestique, avec un total de cinq mélanges maîtres provenant de différents fournisseurs. Les mélanges maîtres et les programmes de température respectifs sont indiqués dans le tableau supplémentaire 7. En général, le type de mélange maître a influencé à la fois les valeurs absolues de Ct et les valeurs de ΔCt entre la cible et les (sous-)espèces à réaction croisée. Cependant, les essais de PCR en temps réel ont été influencés dans une mesure différente. Dans le cas du test Chr9W, par exemple, les mélanges 2 et 3 ont donné des valeurs de Ct plus élevées que le mélange maître 1 (le mélange maître standard dans la présente étude), 4 et 5 (Ct ± SD (n = 6) : mélange 1 : 25,03 ± 0,15 ; mélange 2 : 31,17 ± 1,70 ; mélange 3 : 28,43 ± 0,13 ; mélange 4 : 26,64 ± 0,10 ; mélange 5 : 26,64 ± 0,17). Dans le cas du dosageChr9D, le type de master mix a eu une influence sur les valeurs ΔCt et donc sur la sélectivité du dosage. Les valeurs ΔCt obtenues avec les mélanges maîtres 1, 2, 3 et 4 étaient ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 et ≥ 5,86, respectivement, tandis qu’avec le mélange maître 5, aucune réactivité croisée n’a été observée. Dans le cas de l’essaiChr1, des valeurs de Ct assez similaires ont été obtenues avec les mélanges maîtres 1, 3 et 4. Cependant, les mélanges maîtres 2 et 5 n’ont donné lieu à la formation d’aucun produit, très probablement parce que ces mélanges ne sont pas adaptés au multiplexage. Sur la base de ces résultats, nous recommandons fortement de tester l’applicabilité si un autre type de mélange maître est destiné à être utilisé.

Robustesse

La robustesse des tests PCRs en temps réel a été étudiée en faisant varier la température d’hybridation ±1 °C et le volume du mélange réactionnel par puits de ±5% et en appliquant deux cyclateurs PCR en temps réel différents. Les expériences ont été réalisées avec des isolats d’ADN de sanglier, de porc domestique et de chevreuil. Pour l’essaiChr9W et l’essaiChr9D, les valeurs Ct étaient très similaires à celles obtenues dans des conditions standard (valeurs ΔCt <1,00), sauf lorsque la température de recuit a été augmentée à 61 °C (valeurs ΔCt ≤2,16 et ≤1,57, respectivement). Avec des valeurs ΔCt ≤0,77, l’essaiChr1 s’est révélé encore plus robuste. Ni la réduction du volume total de réaction ni l’utilisation d’un autre cycleur de PCR en temps réel n’ont influencé de manière substantielle les valeurs de Ct, ce qui démontre la robustesse des tests de PCR en temps réel.

Plage de travail, plage linéaire et efficacité d’amplification

En analysant un isolat d’ADN de sanglier (211 µg/mL) et deux isolats d’ADN de porc domestique (158 µg/mL et 160 µg/mL) dilués en série dans l’eau (1 :2-1:524,288), le testChr9W, le testChr9D, le testChr1W et le testChr1D étaient linéaires entre 211 µg/mL et 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL et 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL et 6 ng/mL (R2 = 0,9994) et 160 µg/mL et 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivement (Fig. 3A). Les efficacités d’amplification calculées à partir des pentes des courbes standard étaient de 83 %, 96 %, 93 % et 95 %, respectivement. En outre, la gamme de linéarité a été évaluée en analysant des isolats d’ADN de sanglier et de porc domestique dilués en série dans de l’ADN de sperme de hareng. Pour le testChr9W et le testChr9D, la linéarité allait de 20 µg/mL à 20 ng/mL (R2 = 0,9988) et de 20 µg/mL à 39 ng/mL (R2 = 0,9985), respectivement (Fig. 3B). Dans le cas du testChr1W et du testChr1D, la linéarité était comprise entre 20 µg/mL et 5 ng/mL (R2 = 0,9978) et 20 µg/mL et 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectivement. Les efficacités d’amplification calculées à partir des pentes des courbes standard étaient respectivement de 76%, 90%, 97% et 101%.

Plage de linéarité des quatre essais, (A) déterminé dans l’eau comme fond et (B) déterminé dans l’ADN de sperme de hareng comme ADN de fond non ciblé.

Ces résultats indiquent que la gamme de travail des essais de PCR en temps réel est presque identique, alors que la gamme de linéarité est plus étroite pour les essais ciblant le chromosome 9 que pour ceux ciblant le chromosome 1. Toutes les efficacités d’amplification étaient comprises entre 90 % et 110 %, comme le recommandent les lignes directrices de l’ENGL17, à l’exception du test Chr9W (83 % dans l’eau, 76 % dans l’ADN de sperme de hareng). L’efficacité d’amplification plus faible de l’essaiChr9W est très probablement due à une diminution de la stabilité de la liaison des amorces en raison des mésappariements, introduits pour augmenter la sélectivité pour l’espèce animale cible.

La limite de détection (LOD) dans l’ADN de sperme de hareng et l’ADN de porc comme ADN de fond

La LOD a été définie comme la plus faible concentration d’ADN qui a entraîné une augmentation du signal de fluorescence dans au moins 19 des 20 répétitions. En outre, la valeur Ct doit être inférieure à la valeur Ct obtenue pour les espèces à réaction croisée.

Dans l’ADN de sperme de hareng, la LOD de l’essaiChr9D (1,0%, p/p, Fig. 4A) était légèrement supérieure à la LOD des trois autres tests (0,2 %, p/p, Fig. 4B-D). Le LOD plus élevé du dosageChr9D est causé par la réactivité croisée avec le sanglier (valeur ΔCt entre le sanglier et le porc domestique seulement ≥8,41).

Détermination de la LOD par analyse de dilutions sérielles de (A-D) mélanges d’ADN contenant de l’ADN de sanglier ou de porc domestique dans de l’ADN de sperme de hareng et (E-H) un mélange d’ADN contenant de l’ADN de sanglier dans de l’ADN de porc domestique ou de l’ADN de porc domestique dans de l’ADN de sanglier comme ADN de fond. (A,E) ont été obtenus en utilisant le testChr9D, (B,F) en utilisant le testChr9W, (C,G) en utilisant le testChr1D et (D,H) en utilisant le testChr1W. Les mesures ont été effectuées en 20 répétitions. Les cercles représentent les valeurs Ct individuelles, les lignes horizontales indiquent les valeurs moyennes.

En outre, nous avons déterminé le LOD des tests PCR en temps réel pour le sanglier, assayChr1W et assayChr9W, dans l’ADN de porc domestique comme fond, et celui des tests pour le porc domestique, assayChr1D et assayChr9D, dans l’ADN de sanglier comme fond. Avec 2 %, 0,2 %, 5 % et 2 % (p/p), les LOD du testChr9D (Fig. 4E), du testChr9W (Fig. 4F), du testChr1D (Fig. 4G) et du testChr1W (Fig. 4H) étaient assez différents. Le LOD plus élevé du assayChr1D en présence d’ADN de sanglier a été causé par la suppression du signal, très probablement due à la compétition des deux sondes pour la séquence cible dans le format de l’essai duplex. Pour étudier plus en détail la suppression du signal, des mélanges d’ADN contenant soit 25% (p/p) d’ADN de sanglier dans de l’ADN de porc domestique, soit 25% (p/p) d’ADN de porc domestique dans de l’ADN de sanglier ont été analysés, en plus des contrôles positifs (ADN de sanglier et ADN de porc domestique, respectivement).

Lorsque nous avons comparé les contrôles positifs avec les standards dilués au 1:4 contenant de l’ADN non ciblé, nous n’avons pas trouvé de différence dans les courbes d’amplification (valeurs ΔRn) pour l’assayChr9W et l’assayChr9D (Fig. 5A,B). Cependant, dans le cas du assayChr1W et du assayChr1D, les signaux de fluorescence (valeurs ΔRn) obtenus pour le contrôle positif étaient plus élevés que ceux obtenus pour le standard dilué au 1:4 à la même concentration d’ADN cible (Fig. 5C,D).

Courbes d’amplification (en vue semi-logarithmique) obtenues pour des mélanges d’ADN (20 ng/µL) contenant 25% (p/p) de la sous-espèce cible (sanglier ou porc domestique) et 75% (p/p) de la sous-espèce non cible (sanglier ou porc domestique) et leurs dilutions sérielles (1:4 à 1:1 024). Des isolats d’ADN (5 ng/µL) de sanglier et de porc domestique, respectivement, ont été utilisés comme témoins. Les tests Chr9W (A) et Chr9D (B) présentent une réactivité croisée avec la sous-espèce non ciblée. L’essaiChr1W (C) et l’essaiChr1D (D) montrent une suppression du signal en présence de sous-espèces non ciblées.

Répétitivité

La répétabilité des essais PCR en temps réel a été étudiée en analysant des mélanges d’extraits de viande contenant 30 % (p/p) d’ADN cible et 70 % (p/p) d’ADN de sous-espèces non ciblées ainsi que des dilutions sérielles de ceux-ci, en double cinq fois sur quatre jours différents. Le RSD des valeurs Ct était ≤1,0 % (essaiChr1W), ≤1,9 % (essaiChr9W), ≤2,3 % (essaiChr1D) et ≤3,5 % (essaiChr9D), ce qui démontre la grande répétabilité des essais.

Analyse d’échantillons provenant d’individus de sangliers et de porcs domestiques

Les tests PCR en temps réel ont été appliqués à l’analyse d’échantillons provenant de 64 individus de porcs domestiques, dont 14 races et 6 croisements (Fig. 6A). En outre, nous avons analysé un total de 30 échantillons de sangliers provenant de 5 pays différents (Autriche, Estonie, Allemagne, Roumanie et Etats-Unis, Fig. 6B). Dans le cas d’un individu de sanglier provenant d’Europe, l’origine exacte était inconnue. Chaque échantillon a été analysé dans au moins quatre réplicats. A chaque plaque PCR, un contrôle positif (mélange d’ADN, 10 ng/µL) a été ajouté, contenant la sous-espèce cible dans la même concentration que le LOD, fournissant la valeur Ct de coupure.

Résultats obtenus pour (A) 64 échantillons de porc domestique et (B) 30 échantillons de sanglier. Les mesures ont été effectuées dans au moins quatre répétitions.

Lorsque nous avons analysé les contrôles positifs dans 14 répétitions, la moyenne ± SD des valeurs Ct était de 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) et 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). À l’exception du test Chr9D, tous les échantillons qui ont donné lieu à des valeurs Ct plus élevées ont été considérés comme <LOD. Dans le cas du testChr9D, pour plusieurs échantillons de sanglier, des valeurs Ct ≥ 34,61 ont été obtenues. Afin de réduire la probabilité de résultats faussement positifs, nous avons fixé la valeur Ct de coupure du testChr9D à 34,00. Pour l’application de l’essaiChr9W et de l’essaiChr9D dans les analyses de routine, nous recommandons d’utiliser un contrôle positif composé de 2 % (p/p) d’ADN de porc domestique, 0,2 % (p/p) d’ADN de sanglier et 97,8 % (p/p) d’ADN de sperme de hareng.

Pour l’analyse des échantillons de porc domestique avec l’essaiChr9D, nous avons obtenu 63 résultats positifs et un seul résultat négatif (Mangalica 1) (Fig. 6). Sur les 12 individus Cinta Senese, nous avons analysé deux parties de viande différentes, un échantillon maigre (provenant du longissimus dorsi) et un échantillon de gras dorsal sous-cutané (provenant de la longe) (données non présentées). Les valeurs de Ct obtenues pour les échantillons maigres (Ct moyen ± SD de 25,24 ± 0,44, n = 48) étaient très similaires à celles des échantillons de gras dorsal sous-cutané (26,29 ± 0,35, n = 48). Lorsque nous avons analysé les 30 échantillons de sanglier avec le testChr9D, 21 n’ont pas entraîné d’augmentation du signal de fluorescence, mais neuf individus (un d’Autriche, cinq d’Allemagne et trois des États-Unis) ont été identifiés comme des porcs domestiques.

Avec le testChr9W, la majorité des échantillons de sanglier a été attribuée correctement, seuls trois échantillons (un d’Allemagne et deux des États-Unis) ont obtenu des résultats négatifs. Cependant, l’assayChr9W a également conduit à des résultats positifs pour certains individus de porcs domestiques, dont un Pied noir de Bentheim, trois Krškopolje et trois Mangalica. Notamment, les trois porcs Mangalica d’Autriche ont été identifiés comme des porcs domestiques, tandis que les trois individus d’Allemagne ont été identifiés comme des sangliers. Dans le cas du testChr9, y compris le testChr9W et le testChr9D, 12 des 94 échantillons de viande ont donné des résultats ambigus, car une augmentation du signal de fluorescence a été obtenue avec les deux tests PCR en temps réel. En outre, un individu de porc Mangalica a été identifié comme sanglier et trois individus de sanglier comme porc domestique.

Dans l’étude de Beugin et al.11, la pertinence du SNP rs81416363 avait été testée sur des sangliers  » purs  » chassés dans un parc naturel des Vosges en France et un nombre limité de races porcines commerciales (Landrace, Large White, Piétrain et Duroc). Les sangliers ont été trouvés porteurs de l’allèle G (fréquence 100%, pas d’hétérozygotie), les porcs domestiques de l’allèle A (fréquence 98%, hétérozygotie 5%).

Pour savoir pourquoi l’essaiChr9W et l’essaiChr9D ont conduit à plusieurs erreurs de classification et à certains résultats ambigus, nous avons génotypé les échantillons respectifs de sangliers et de porcs domestiques par analyse de fusion à haute résolution (HRM). Nous avons appliqué l’analyse HRM car il s’agit d’une technique puissante, rapide et économique pour le génotypage des SNP18. Les courbes de fusion normalisées (Fig. 7A) indiquent que le génotype G homozygote a été trouvé non seulement pour les échantillons de sanglier, mais aussi pour l’échantillon de Mangalica (échantillon 1) pour lequel une augmentation du signal de fluorescence a été obtenue avec l’analyseChr9W mais pas avec l’analyseChr9D. Les échantillons de sanglier pour lesquels une augmentation du signal de fluorescence a été obtenue avec le testChr9D se sont avérés être porteurs d’au moins une copie de l’allèle A. Quatre individus de sanglier présentaient le génotype hétérozygote, cinq étaient homozygotes pour l’allèle A. En outre, cinq individus de porc domestique, dont trois individus de Krškopolje en Slovénie, ont été trouvés porteurs de l’allèle A et de l’allèle G. Ainsi, par le génotypage HRM, nous avons pu vérifier que les résultats obtenus avec les assayChr9W et assayChr9D étaient en accord avec les génotypes respectifs des individus. Cependant, nos résultats indiquent que les deux tests singleplex ciblant le SNP rs81416363, assayChr9W et assayChr9D, ne permettent pas de discriminer sans ambiguïté le sanglier et le porc domestique.

Courbes HRM normalisées pour (A) le SNP rs81614363 (g.118314929. A > G) sur le chromosome 9 pour l’homozygote G (sanglier), l’homozygote A (porc domestique) et l’hétérozygote A + G et (B) le SNP g.299084751 C > T sur le chromosome 1 pour l’homozygote C (sanglier), l’homozygote T (porc domestique) et l’hétérozygote C + T.

Avec le testChr1D, tous les échantillons de porc domestique sauf trois ont été classés comme porc domestique (Fig. 6). Conformément au dosageChr9D, les valeurs de Ct obtenues pour les échantillons de maigre et de graisse dorsale sous-cutanée des 12 individus Cinta Senese étaient très similaires (Ct moyen ± SD de 25,99 ± 0,25 (n = 48) et 26,36 ± 0,25 (n = 48), respectivement). Cependant, avec l’essaiChr1D également, cinq des 30 échantillons de sanglier ont été identifiés comme étant des porcs domestiques. L’analyse des échantillons de sanglier avec l’assayChr1W n’a donné qu’un seul résultat négatif. Cependant, également un échantillon de Mangalica et six individus de Turopolje ont conduit à une augmentation du signal de fluorescence avec assayChr1W.

Dans l’étude de Fontanesi et al.10 le SNP g.299084751 C > T avait été génotypé en analysant les échantillons de 293 porcs domestiques de cinq races commerciales (Large White italien, Landrace italien, Duroc italien, Landrace belge et Piétrain) et 201 sangliers sauvages d’Europe centrale du Sud (Italie du Nord) et d’Europe du Sud-Est (Slovénie et régions des Balkans occidentaux). Fontanesi et al. ont trouvé que tous les individus de porc domestique étaient homozygotes pour l’allèle T. 7,5 % des sangliers étaient porteurs d’au moins une copie de l’allèle T, les individus d’Europe du Sud-Est étant plus nombreux (12,2 %) que ceux d’Europe centrale et du Sud (3,6 %). 11,1 % des sangliers d’Europe du Sud-Est étaient du génotype hétérozygote C/T.

Lorsque nous avons génotypé les individus de sanglier et de porc domestique pour le SNP g.299084751 C > T par analyse HRM, nous avons également détecté l’allèle T non seulement chez les porcs domestiques mais aussi chez certains sangliers (Fig. 7B). L’individu de sanglier provenant des Etats-Unis présentait le génotype T homozygote tandis que l’individu de sanglier provenant de Basse-Autriche portait à la fois l’allèle C et T. La majorité des individus de sanglier était cependant homozygote pour l’allèle C. Ce résultat indique que l’augmentation du nombre de sangliers est due à l’augmentation du nombre d’animaux. Ce résultat indique que l’augmentation du signal de fluorescence pour trois échantillons de sangliers (Allemagne Bad Kissingen et Perleberg, et Europe) obtenue avec le testChr1D ne correspondait pas à leur génotype et était donc due à une réactivité croisée. La majorité des individus de porcs domestiques s’est avérée être homozygote pour l’allèle T. Cependant, six des huit individus de Turopolje présentaient le génotype hétérozygote C/T, ce qui explique pourquoi une augmentation du signal de fluorescence a été obtenue à la fois avec le testChr1D et le testChr1W. La fréquence élevée du génotype C/T hétérozygote chez Turopolje, une race de porc domestique de Croatie, est conforme à un article très récent du groupe de recherche de Fontanesi. En génotypant 47 individus Turopolje, la fréquence de l’allèle T et C a été rapportée à 0,57 et 0,43, respectivement19.

Nos résultats démontrent que ni les deux tests singleplex ciblant le SNP rs81416363 ni le test duplex ciblant le SNP g.299084751 C > T ne permettent à eux seuls de discriminer sans ambiguïté le sanglier et le porc domestique. Cependant, en prenant en compte les résultats des deux tests singleplex et du test duplex, le pouvoir de discrimination peut être considérablement augmenté. Nos résultats démontrent que si les deux tests pour la même sous-espèce (par exemple assayChr9D et assayChr1D) mènent à une classification identique (dans l’exemple donné du porc domestique), et que les résultats obtenus avec les deux tests pour l’autre sous-espèce (dans l’exemple donné assayChr9W et assayChr1W) sont ambigus, la probabilité d’une classification erronée est faible si l’on se base sur les résultats identiques. En suivant cette stratégie, 86 (91,5%) des 94 individus ont pu être attribués correctement.