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Restriction-modification

Les systèmes de restriction-modification (RM) sont présents de manière ubiquitaire dans le règne procaryote où ils servent de systèmes de défense contre l’ADN étranger. Actuellement, 47 systèmes de type I, 3320 de type II et huit de type III sont connus. R. Roberts (Beverly, MA) souligne que, jusqu’à récemment, les enzymes de restriction ont été identifiées en obtenant des bactéries à partir de collections de cultures et d’échantillons environnementaux et en les analysant pour l’activité de restriction. Il est maintenant possible de cribler de nouvelles séquences d’ADN pour trouver des gènes d’ADN méthyltransférase (MTase), qui peuvent être identifiés par leurs motifs conservés, puis de rechercher des gènes associés. Ces derniers sont de bons candidats pour les gènes des endonucléases de restriction, car les gènes des ADN méthyltransférases et des endonucléases de restriction sont souvent liés. Les récents projets relatifs au génome ont permis d’identifier de cette manière un nombre étonnamment élevé de systèmes RM putatifs. Par exemple, 25 gènes de MTase différents ont été identifiés dans le génome d’Helicobacter pylori, et certains d’entre eux étaient associés à des gènes d’enzymes de restriction. Le criblage des bases de données peut donc devenir une méthode très productive pour trouver des enzymes de restriction avec de nouvelles spécificités. A. Piekarowicz (Varsovie, Pologne) a présenté un exemple d’une telle approche qui a conduit à l’identification d’une nouvelle enzyme de restriction de type IC, NgoAXVI.

Les enzymes de restriction de type I et de type III, ainsi que l’enzyme McrBC dépendante du méthyle, nécessitent deux sites de reconnaissance et dépendent de l’hydrolyse de l’ATP (McrBC : GTP) pour le clivage de l’ADN (revue dans Rao et al., 2000). Le clivage se produit lorsque deux de ces enzymes entrent en collision lors de la translocation de l’ADN, ce qui explique la nécessité de deux sites (figure 2.2). T. Bickle (Bâle, Suisse) a démontré que les enzymes de type I et McrBC peuvent également être stimulées pour cliver l’ADN lorsqu’elles se heurtent à un blocage non spécifique. Les enzymes de type III, en revanche, sont inhibées par de tels blocages, car chaque enzyme translocatrice ne coupe qu’un brin et nécessite la coopération d’une autre enzyme pour le clivage des deux brins d’ADN.

Fig. 2. Modèle d’activation des enzymes de restriction qui nécessitent de l’ATP (ou du GTP) pour le clivage de l’ADN. Après la liaison de deux molécules d’enzymes (ou complexes) à deux sites de reconnaissance sur une molécule d’ADN linéaire, l’ADN est transloqué dans un processus actif, dépendant de l’énergie, qui nécessite de l’ATP ou du GTP, selon le système. L’ADN est ainsi bouclé. Le clivage se produit après la collision de deux complexes transloquants, à des sites aléatoires à proximité des sites de reconnaissance (enzymes de type III et McrBC) ou plus éloignés d’eux (enzymes de type I).

Bien que la plupart des enzymes de restriction de type II soient des homodimères qui interagissent avec une copie de leur site de reconnaissance palindromique, il existe des sous-types qui nécessitent la coopération de deux sites (revue dans Pingoud et Jeltsch, 1997). Comme l’a souligné S. Halford (Bristol, UK), c’est le cas non seulement des enzymes de type IIe, comme NaeI, mais aussi des enzymes de type IIf, comme SfiI, et des enzymes de type IIS, comme FokI. Les enzymes de type IIf sont des homotétramères avec deux sites de liaison à l’ADN distincts, chacun formé par deux sous-unités. La SfiI n’est active que lorsque les deux sites de liaison à l’ADN sont occupés, ce qui entraîne un clivage simultané des deux sites. Pour FokI, qui consiste en un domaine de clivage et un domaine de reconnaissance, il a été démontré précédemment que la dimérisation de l’enzyme sur l’ADN est nécessaire pour que le clivage ait lieu. Halford a maintenant montré que deux sites de reconnaissance sont nécessaires pour un clivage efficace, car chacun des domaines de reconnaissance doit interagir avec une séquence de reconnaissance. Les trois types d’enzymes agissent de manière optimale avec deux sites sur le même ADN, où ils piègent l’ADN entre les sites dans une boucle.

Des enzymes de restriction atypiques de type II continuent d’être découvertes. BbvCI est une enzyme de restriction hétérodimérique qui reconnaît une séquence asymétrique. Les sous-unités sont inactives individuellement, mais actives ensemble. Il est donc possible de créer des enzymes de coupure spécifiques en inactivant une sous-unité par mutagenèse dirigée, comme l’a signalé G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Lituanie) a obtenu un résultat similaire pour l’enzyme de restriction hétérodimérique Bpu10I. Il a également réussi à assouplir la spécificité du substrat de Eco57I, une enzyme de restriction et de modification monomérique, qui possède un seul domaine de reconnaissance de la cible. Dans cette étude, la mutagenèse aléatoire a été utilisée pour générer une variante qui interagit non seulement avec le site canonique CTGAAG, mais aussi avec les sites CTGGAG. La base moléculaire de cette spécificité relaxée doit encore être déterminée. V. Siksnys (Vilnius, Lituanie) a signalé la découverte d’une nouvelle enzyme de restriction de type IIs, BfiI, qui ne dépend pas des ions métalliques divalents pour le clivage. Cette enzyme présente une similarité de séquence avec une nucléase non spécifique de Salmonella typhimurium et utilise vraisemblablement un mécanisme catalytique similaire.

A. Pingoud (Giessen, Allemagne) a discuté du mécanisme de clivage de l’ADN par les enzymes de restriction de type II et les endonucléases homing, qui partagent une fonction commune, mais ont en général des structures différentes et suivent vraisemblablement des mécanismes de clivage différents. Malgré le fait que des informations détaillées sur la structure sont disponibles pour de nombreuses enzymes de restriction qui partagent un motif catalytique commun, il n’y a pas de consensus concernant le mécanisme catalytique ou le nombre d’ions Mg2+ qui sont impliqués dans la catalyse. En principe, il en va de même pour d’autres phosphoryltransférases possédant un centre catalytique semblable à celui des enzymes de restriction. Des exemples de telles protéines sont l’enzyme de réparation Vsr (E. coli) et la résolvase Hjc (Pyrococcus furiosus). La structure cristalline de cette dernière a été présentée par K. Morikawa (Osaka, Japon) (Figure (Figure3).3). En revanche, le mécanisme de clivage de l’ADN par les endonucléases homing de la famille HNH, par exemple I-PpoI, semble mieux établi, car des informations structurelles sont disponibles pour l’enzyme libre ainsi que pour les complexes enzyme-substrat et enzyme-produit, en plus d’informations biochimiques détaillées pour cette enzyme et les enzymes apparentées de la superfamille ‘ββα-Me finger’. Ces enzymes nécessitent un ion Mg2+ comme cofacteur qui est lié à un Asn conservé. L’ion hydroxyle attaquant est généré par un His conservé, la stabilisation de l’état de transition implique un Arg conservé et la protonation du groupe partant est permise par une molécule d’eau de la sphère d’hydratation de l’ion Mg2+.

Les bactéries ont développé des systèmes RM pour combattre les bactériophages. Ces derniers ont à leur tour développé divers moyens d’échapper à la restriction des systèmes RM bactériens. D. Dryden (Edinburgh, UK) a rapporté les résultats d’une analyse biochimique de la protéine du gène 0.3 du bactériophage T7, qui est un inhibiteur des enzymes de modification de restriction de type I. Cette protéine se lie stoechiométriquement aux enzymes de modification de restriction. Cette protéine se lie stoechiométriquement à l’enzyme de restriction et, en raison de sa forme allongée et de sa charge de surface négative, remplit vraisemblablement complètement le site de liaison à l’ADN de l’enzyme et empêche ainsi la liaison à l’ADN.

Les systèmes de MR sont constitués d’endonucléases de restriction et d’ADN méthyltransférases (MTases) (revues dans Cheng, 1995 ; Robertson et Wolffe, 2000). Cependant, comme le schéma de méthylation de l’ADN ajoute des informations à l’ADN et étend ainsi sa capacité de codage, les MTases ne sont pas seulement les compagnes des enzymes de restriction dans les systèmes RM, mais ont de nombreuses autres fonctions vitales. Chez les procaryotes, elles jouent un rôle dans la réparation de l’ADN et la régulation de l’expression des gènes et de la réplication de l’ADN. Chez les eucaryotes, la méthylation de l’ADN conduit généralement à l’extinction transcriptionnelle des gènes. Elle contribue aux processus épigénétiques tels que l’inactivation du chromosome X, l’empreinte génétique et la régulation des gènes. Avec la découverte que plusieurs ADN MTases sont essentielles au développement chez la souris, l’importance de la méthylation de l’ADN est devenue largement acceptée.

X. Cheng (Atlanta, GA) a présenté la structure de la protéine Dnmt2, qui pourrait être la première structure d’une ADN MTase eucaryote. La protéine a un pli de MTase et possède tous les motifs catalytiques caractéristiques, mais semble être dépourvue de toute activité catalytique. Cela soulève des questions comme celle de savoir s’il s’agit bien d’une enzyme et quel est son substrat (ADN, ARN ou autre). D’autres discussions sur les enzymes eucaryotes par Cheng et A. Jeltsch (Giessen, Allemagne) ont porté sur les enzymes Dnmt1, Dnmt3a et Dnmt3b. Les deux conférenciers ont rapporté les résultats obtenus avec des protéines tronquées et des domaines isolés de ces énormes enzymes (comprenant jusqu’à 1700 résidus d’acides aminés), tout en présentant des résultats concernant l’analyse enzymatique des enzymes purifiées. Comme le domaine catalytique de Dnmt1 (∼500 résidus d’acides aminés) n’est pas actif sous forme isolée, il doit être sous le contrôle étroit d’autres parties de l’enzyme. Cette interaction pourrait être nécessaire pour assurer une haute spécificité pour l’ADN hémiméthylé. Malgré les progrès réalisés dans ce domaine, le processus de méthylation de l’ADN chez les eucaryotes, en particulier les mécanismes qui créent le schéma de méthylation de l’ADN, est encore mal compris.

On en sait un peu plus sur la méthylation de l’ADN chez les procaryotes. R. Gumport (Urbana, IL) a présenté la structure de la MTase procaryote M.RsrI, confirmant la conjecture selon laquelle les domaines catalytiques de toutes les MTases partagent une architecture commune. S. Klimasauskas (Vilnius, Lituanie), D.N. Rao (Bangalore, Inde), Gumport et Jeltsch ont discuté de l’enzymologie moléculaire de quatre MTases procaryotes (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI et M.EcoRV). Le cycle catalytique de ces enzymes implique la liaison de l’ADN et des cofacteurs, la localisation et la reconnaissance du site cible, et les changements de conformation du complexe, y compris le basculement des bases et le transfert des groupes méthyles (Figure (Figure4).4). Des différences de détail sont apparues ; par exemple, l’ordre de liaison du substrat et du cofacteur et l’étape limitant la vitesse diffèrent dans les diverses MTases. La 2-aminopurine s’est avérée être un bon outil pour analyser la cinétique des changements de conformation que l’ADN subit en complexe avec les MTases, y compris le basculement des bases.

Fig. 4. Mécanisme de localisation du site cible par les endonucléases de restriction et les ADN méthyltransférases. L’ADN est d’abord lié de manière non spécifique, puis le site cible est localisé par diffusion facilitée (glissement et saut) sur l’ADN. Les contacts avec les sites cibles induisent des changements de conformation de l’enzyme et de l’ADN qui, à leur tour, déclenchent la catalyse. Ce mécanisme est commun à la plupart des enzymes qui interagissent spécifiquement avec l’ADN.

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