Le test immuno-enzymatique (ELISA) est un test immunologique couramment utilisé pour mesurer les anticorps, les antigènes, les protéines et les glycoprotéines dans les échantillons biologiques. Quelques exemples : le diagnostic de l’infection par le VIH, les tests de grossesse et la mesure des cytokines ou des récepteurs solubles dans le surnageant cellulaire ou le sérum. Les tests ELISA sont généralement réalisés dans des plaques à 96 puits, ce qui permet de mesurer plusieurs échantillons en une seule expérience. Ces plaques doivent être des plaques absorbantes spéciales (par exemple, les plaques NUNC Immuno) pour garantir que l’anticorps ou l’antigène adhère à la surface. Chaque ELISA mesure un antigène spécifique, et des kits pour une variété d’antigènes sont largement disponibles.
L’ELISA représenté sur la figure 1 est ce que l’on appelle un ELISA sandwich, ici deux ensembles d’anticorps sont utilisés pour détecter les produits sécrétés, par exemple les cytokines. La méthode se déroule par étapes dans l’ordre indiqué. La première étape consiste à recouvrir la plaque ELISA d’un anticorps de capture. Tout anticorps excédentaire non lié est ensuite éliminé de la plaque par lavage. L’anticorps de capture est un anticorps élevé contre l’antigène d’intérêt.
Figure 1. Méthode ELISA. Décrit ci-dessus est un ELISA sandwich, montrant les étapes du dosage, numérotées dans l’ordre 1-4.
Puis l’échantillon (par exemple l’urine, le sérum, ou le surnageant cellulaire) est ajouté. Tout antigène présent dans l’échantillon se fixera à l’anticorps de capture qui recouvre déjà la plaque. Les échantillons sont généralement ajoutés en double ou en triple (pour permettre une analyse statistique), et à des concentrations variables pour garantir qu’ils se situent dans les niveaux de détection du test. Là encore, tout échantillon en excès est lavé de la plaque.
À l’étape 3, l’anticorps de détection est ajouté. Cet anticorps est marqué par une enzyme, généralement la peroxydase de radis de cheval ou la phosphatase alcaline. L’anticorps de détection se lie à tout antigène cible déjà lié à la plaque. Enfin, un substrat est ajouté à la plaque. Les tests ELISA sont généralement chromogènes en utilisant une réaction qui convertit le substrat (par exemple TMB ou ABTS) en un produit coloré qui peut être mesuré à l’aide d’un lecteur de plaque.
La détermination de la concentration d’antigène dans un échantillon nécessite la production d’une courbe standard en utilisant des antigènes d’une concentration connue (illustrée dans la figure 2). La concentration d’antigène dans un échantillon peut alors être calculée en utilisant la densité optique (DO).
Figure 2. Une courbe standard typique. La figure montre une courbe standard pour un IFN-γ ELISA. Pour calculer la concentration d’antigène dans un échantillon, une courbe standard utilisant une solution de concentration connue doit être préparée.