A nyugat-lothiai Linlithgow palotában született 1542. december 8-án, Mária hatnapos korában lett skót királynő.
Az angol trónra való igényei majdnem olyan erősek voltak, mint a skót trónra való igényei. VII. Henrik angol király dédunokájaként Mária VIII. Henrik gyermekei után a következő volt a sorban az angol trónra.
Fiatalságára és nemére való tekintettel a skót nemesség úgy döntött, hogy békét kell kötniük Angliával, és megegyeztek abban, hogy Mária feleségül megy VIII. Henrik fiához, a későbbi VI. Edwardhoz.
Alighogy azonban megkötötték a szerződést, a tervet ellenző katolikusok a fiatal Máriát Stirling várába vitték, és Henrik dühére felbontották a frigyet, mivel inkább visszatértek Skócia hagyományos, Franciaországgal kötött szövetségéhez.
Henrik ezután elrendelte a “Durva udvarlás” néven ismert kegyetlen skóciai portyasorozatot. Serege felgyújtotta a Holyroodhouse-i apátságot, ahol V. Jakabot eltemették, felégette a Tweed-völgyben a termést, és felgyújtotta Melrose, Jedburgh és Dryburgh határ menti apátságait.
A skótok 1548-ban eljegyezték Máriát II. Henrik francia király örökösével, Ferenc dauphinnal, és a francia udvarba küldték, hogy ott neveljék fel. Állítólag a Stewart királyi családnév írásmódja ekkor változott Stuartra, hogy megfeleljen a francia hagyományos helyesírásnak.
A magas, kecses és gyors eszű Mária 1558. április 24-én Párizsban feleségül ment a dauphinhez. Apja trónjára 1559-ben lépett, így Mária nemcsak Skócia, hanem Franciaország királynője is lett, de uralkodása rövid volt, mert 1560-ban fülgyulladásban meghalt.
A következő évben, barátai figyelmeztetései ellenére Mária úgy döntött, hogy visszamegy Skóciába, amely a John Knox által vezetett vallási reformok után immár hivatalosan protestáns ország volt.
Római katolikus volt, de féltestvére, Lord James Stewart, a későbbi Moray grófja biztosította őt arról, hogy úgy imádkozhat, ahogy akar, és 1561 augusztusában visszatért, és váratlanul meleg fogadtatásban részesült protestáns alattvalói részéről.
Mária eleinte sikeresen és mértéktartóan kormányzott, Lord James és William Maitland of Lethington, egy finom diplomata tanácsaival. Azonban 1565-ben kötött házassága másodunokatestvérével, Henryvel, Lord Darnleyvel (VII. Henrik dédunokájával) tragikus eseménysorozatot indított el, amelyet a pártütő skót nemesek csak tovább rontottak.
A megrontott és ingerlékeny Darnley Mária ellenségeinek eszközévé vált, és összeesküvők egy csoportjával betört a vacsoraterembe, megfenyegette az erősen terhes királynőt, és 1566. március 9-én a Holyroodhouse palotában meggyilkolta titkárát, David Ricciót.
Mária és Darnley fiának, Jamesnek a születése azon a nyáron semmit sem javított a kapcsolatukon, és amikor Darnleyt 1567. február 10-én meggyilkolták Kirk o’Fieldben, Edinburgh falai előtt, az emberek azt gyanították, hogy a királynőnek köze van a bűncselekményhez.
Három hónappal később kötött házassága Bothwell grófjával (akit általában a fő gyilkosnak tartottak) elkerülhetetlenül a vesztét hozta. Protestáns lordjai fellázadtak ellene, és serege 1567. június 15-én az Edinburgh melletti Carberry Hillnél szembeszállt az övékkel.
Megadta magát, a Kinross-shire-i Lochleven kastélyban raboskodott, és kénytelen volt lemondani csecsemő fia javára. Bothwell Skandináviába menekült, ahol letartóztatták és haláláig fogva tartották.
Mary 1568-ban megszökött Lochlevenből, de a Glasgow melletti Langside-i csatában május 13-án vereséget szenvedett. Délre menekülve Angliában keresett menedéket, abban a hitben, hogy I. Erzsébet királynő támogatni fogja az ügyét, ehelyett azonban 19 évig tartották fogságban Angliában.
Az Erzsébet elleni római katolikus összeesküvések hosszú sorozatának középpontjában, amely az angol királynő meggyilkolására irányuló Babington-összeesküvésben csúcsosodott ki, Erzsébet miniszterei Mária kivégzését követelték: “amíg őbenne élet van, addig van remény; amíg ők reményben élnek, addig mi félelemben élünk”.
Máriát végül a northamptonshire-i Fotheringhay kastélyban végezték ki 1587. február 8-án, 44 éves korában.
A Peterborough-i székesegyházban temették el, de 1612-ben fia, VI. és I. Jakab exhumáltatta a holttestét, és a Westminster apátságban, VII. Henrik király kápolnájának sírboltjában helyezték el.