5.5.9 A trikarbonsavciklus
A piruvát a TCA-ciklusban az oxidatív glükózanyagcsere katabolikus sorozatának és a C3 prekurzorokból kiinduló glükoneogén útvonalnak az elágazási pontja. Mindkét útvonalban a piruvát belép a TCA-ciklusba, ahol vagy oxidatív módon dekarboxilálódik acetil-CoA-vá a piruvát-dehidrogenázon keresztül, vagy a piruvát-karboxiláz reakcióban oxalacetáttá karboxilálódik. Mivel a PC és a PDH versengenek a piruvátért, kulcspozícióban vannak az anaplerotikus (azaz feltöltő), illetve az oxidatív anyagcsere szabályozásában. Cohen és munkatársai (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) jelölt és nem jelölt alanin vagy piruvát és etanol kombinációival vizsgálták a máj szubsztrátversenyt a TCA-ciklusba való belépésért különböző hormonális és étrendi állapotok mellett perfundált patkány- és egérmájban.
Amikor az alanin volt az egyetlen hepatikus szubsztrát, a C2, C3 és C4 glutamát és glutamin könnyen jelölődött, ahogy az a TCA-ciklus topológiája alapján várható volt (Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a). Az alanin transzaminálódik piruváttá, amely vagy acetil-CoA-ra dekarboxilálódik, vagy oxalacetáttá karboxilálódik. Az acetil-CoA citráttá, majd α-ketoglutaráttá épül be, amely viszont glutamáttá transzaminálódhat. Másrészt az oxalacetát egyensúlyban van a maláttal és a fumaráttal (lásd az 5.5.8. szakaszt), és a címke az oxalacetát C2- és C3-ba keveredik. Az ilyen oxalacetát izotópok kondenzációja acetil-CoA-val a citrát-szintáz reakcióban később – és α-ketoglutarát, és így – és glutamát keletkezik. A PC-n és a PDH-n keresztül a TCA-ciklusba belépő piruvát relatív aránya ezért a glutamát C2 és C4 relatív dúsulása alapján becsülhető. Egy elsőrendű modell feltételezése mellett, amelyben a TCA-ciklusnak csak egy fordulatát vesszük figyelembe, és elhanyagoljuk a címke folyamatos újrahasznosítását (lásd az 5.3.7. szakaszt), Cohen (1983, 1987c) kiszámította a PC és a PDH fluxusának arányát, amely 1,2 és 2,6, illetve 7,7 között mozgott jól táplált, diabéteszes és 24 órás koplaláson átesett donorpatkányok májában. A diabéteszes májban a két alternatív útvonalon keresztül a TCA-ciklusba becsatornázott piruvát relatív arányát nem változtatta meg az in vitro inkubáció inzulinnal.
Azokkal a kísérletekkel ellentétben, ahol az alanin volt a máj metabolizmusának egyetlen szubsztrátja, a nem jelölt etanol együttes hozzáadása lényegében jelölés nélküli glutamát C4 és glutamin C4-et eredményezett (Cohen et al., 1979b). Az etanol, amelyet az alkohol-dehidrogenáz könnyen oxidál acetaldehiddé, majd tovább acetáttá, az acetil-CoA további forrásaként szolgál. Az eredmények azt mutatták, hogy az etanolból származó acetil-CoA hatékonyan versenyez a PDH-n keresztül a TCA-ciklusba belépő acetil-CoA-val. Így az acetil-CoA alternatív forrásának jelenlétében az alanin szinte kizárólag a PC-reakción keresztül jutott be a TCA-ciklusba. Továbbá, az alanin etanollal való együttes adagolása csaknem 50%-kal növelte az alanin PC-reakción keresztül történő felhasználásának sebességét a csak alaninnal perfundált májakhoz képest. Ez az eredmény nem váratlan az acetil-CoA szintje által szabályozott PC-reakció fényében. Az acetil-CoA megnövekedett koncentrációja, mint amilyen az etanol metabolizmusa során rendelkezésre állt, megnövelte a PC-n keresztüli fluxust, hogy az oxalacetát-poolt megnövelje az acetil-CoA gyorsított fogyasztásához a TCA-ciklusban. Hasonló kísérleteket végeztek jelölt piruváttal + NH4C1 és etanollal mint szubsztrátokkal, és azok egyenértékű eredményeket adtak (Cohen, 1987a,b). Továbbá Nedelec és munkatársai (1990b) a Cohen (1983) által javasolt modellt használták a vírus által kiváltott myeloproliferatív leukémia máj anyagcserére gyakorolt hatásának értékelésére. A koplaltatott donorok fertőzött májában az alanin-anyagcsere hasonlónak bizonyult a táplált kontrollokhoz. Mindkét csoport májában csökkent a PC versus PDH hozzájárulása az alanin TCA-ciklusba történő áramlásához az éhező kontrollokhoz képest. A PC/PDH fluxus megváltozott arányát a leukémiás éheztetett májakban a trigliceridek és így az acetil-CoA drasztikusan csökkent elérhetőségével magyarázták ezekben a szervekben.
A 13C MRS egyedülálló lehetőséget kínál az etanol és az alanin metabolizmusának egyidejű követésére (lásd a 8. ábrát). Azokban a kísérletekben, ahol alanint és etanolt használtak szénforrásként, két különböző jelölési mintázatú acetil-CoA keletkezett (Cohen, 1987b). Az alanin TCA-ciklusba való belépésekor a PDH reakción keresztül acetil-CoA keletkezik, az etanolból pedig acetil-CoA származik. Az acetil-CoA beépülése a citrát, α-ketoglutarát, glutamát és glutamin C4 és C5 pozíciókban történő jelölése mellett a glutamát és a glutamin C4 és C5 szomszédos szénatomjai között jellegzetes spincsatolásokat eredményez, amelyek könnyen megkülönböztethetők az alanin beépülése által létrehozott szingulett-rezonanciáktól. Ezért az alanin és az etanol közötti versengés közvetlen becslését a glutamát C4-ének szinglet-multiplet arányának elemzéséből kaphatjuk meg. A spin-kapcsolási mintázatok elemzése hasznos volt a perfundált májból nyert 13C MR-spektrumokban megfigyelt glutationból származó rezonanciák hozzárendeléséhez is (Cohen, 1987a). A 13C-jelölt prekurzorokkal történő májperfúzió során a glutationban a glutamil-rész tekintetében észlelt spin-kapcsolási mintázatok szorosan megegyeztek a glutamátban megfigyelt jelölési mintázattal. Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a glutamát szénváza érintetlen maradt, és közvetlenül beépült a de novo szintetizált glutationba. A máj PCA-kivonatokban mért kémiai eltolódások azt jelezték, hogy a glutation redukált formában van jelen.
A glutamát mellett számos kísérletben megfigyelték a máj glutaminjának jelölését is. Ez nem meglepő, mivel a glutamin könnyen képződik a glutamin-szintáz reakcióban. Cohen és munkatársai (1979b) a hepatikus glutamátba és glutaminba történő jelölés beépülésének időbeli lefolyását követték alanin és jelölt vagy nem jelölt etanol jelenlétében perfundált egérmájakban. Minden vizsgált körülmények között a glutaminban való feldúsulás elmaradt a glutamáté mögött, amint azt a glutamát és a glutamin 13C MR jelintenzitásának C4/C2 aránya mutatja. A glutaminnál egy adott időpontban megfigyelt C4/C2 arány nem volt azonos a glutamát megfelelő arányával, hanem a kb. 1 órával korábbi glutamát arányt tükrözte. Ezt az időkülönbséget az in vivo allosztérikusan szabályozott glutamin-szintáz reakción keresztüli fluxus mérésére használtuk. Hasonló eredményeket kaptunk acetáttal perfundált patkánymájból is (Desmoulin és mtsai., 1985; Canioni és mtsai., 1985). A glutamátban és glutaminban történő jelölés értelmezését azonban egy lépéssel tovább vitték. A szerzők felvetették, hogy a glutamát és a glutamin egy hiábavaló ciklusban vehet részt, amely a citoszolikus glutamin-szintáz, a mitokondriális glutamináz és a mitokondriális membránokon keresztüli glutamát/glutamin csere aktivitását foglalja magában.
Alaninnal és etanollal vagy piruváttal, ammónium-kloriddal és etanollal perfundált koplalt májban C2 és C3 helyen jelölt aszpartát és N-karbamoylaspartát volt megfigyelhető (Cohen, 1987a). A jelölt aszpartát kimutatása nem váratlan, mivel az könnyen képződik a TCA-ciklus oxalacetát intermedierjének transzaminációjával. Az N-karbamoylaspartát azonban a májban a de novo pirimidin-nukleotidszintézis egyik első lépése során keletkezik. Az N-karbamoylaspartát beépíti az ép aszpartát-részt, ami a megfigyelt jelölési mintázathoz vezet. A 13C-jelölés további kimutatása az út végtermékeiben, például az uridinben és annak foszforilációs termékeiben, azt jelzi, hogy a perfundált májban az N-karbamoylaspartát nettó szintézisét figyelték meg, szemben a forgalommal (Cohen, 1987a).