Restriction-modification
Restriction-modification (RM) rendszerek mindenütt megtalálhatók a prokarióta birodalomban, ahol az idegen DNS elleni védekező rendszerekként szolgálnak. Jelenleg 47 I. típusú, 3320 II. típusú és nyolc III. típusú rendszer ismert. R. Roberts (Beverly, MA) rámutatott, hogy a közelmúltig a restrikciós enzimeket úgy azonosították, hogy tenyésztési gyűjteményekből és környezeti mintákból nyertek baktériumokat, és elemezték azokat restrikciós aktivitás szempontjából. Most már lehetséges új DNS-szekvenciákat szűrni DNS-metiltranszferáz (MTáz) génekre, amelyeket konzervált motívumaik alapján lehet azonosítani, majd keresni a kapcsolódó géneket. Ezek jó jelöltek a restrikciós endonukleáz génekre, mivel a DNS-metiltranszferázok és a restrikciós endonukleázok génjei gyakran összekapcsolódnak. A közelmúlt genomprojektjei váratlanul sok feltételezett RM-rendszert azonosítottak ilyen módon. Például a Helicobacter pylori genomban 25 különböző MTáz gént azonosítottak, és ezek közül néhányat restrikciós enzim génekkel társítottak. Az adatbázisok szűrése tehát igen produktív módszerré válhat az új specificitású restrikciós enzimek megtalálására. A. Piekarowicz (Varsó, Lengyelország) beszámolt egy ilyen megközelítés egyik példájáról, amely egy új típusú IC restrikciós enzim, az NgoAXVI azonosításához vezetett.
Az I. és III. típusú restrikciós enzimek, valamint a metilfüggő McrBC enzim két felismerőhelyet igényelnek, és a DNS hasításához ATP (McrBC: GTP) hidrolízisétől függnek (review in Rao et al., 2000). A hasítás akkor következik be, amikor két ilyen enzim összeütközik a DNS transzlokációja során, ami megmagyarázza a két hely szükségességét (2. ábra (2. ábra).2). T. Bickle (Basel, Svájc) kimutatta, hogy az I. típusú enzimek és a McrBC is stimulálhatók a DNS hasítására, ha nem specifikus blokkba ütköznek. A III. típusú enzimeket ezzel szemben gátolják az ilyen blokkok, mert minden transzlokálódó enzim csak az egyik szálat vágja el, és mindkét DNS-szál hasításához egy másik enzim együttműködésére van szükségük.
2. ábra. A DNS hasításához ATP-t (vagy GTP-t) igénylő restrikciós enzimek aktiválásának modellje. Miután két enzimmolekula (vagy komplex) egy lineáris DNS-molekula két felismerőhelyéhez kötődik, a DNS egy aktív, energiafüggő folyamat során transzlokálódik, amelyhez a rendszertől függően ATP vagy GTP szükséges. Ezáltal a DNS hurokba kerül. A hasítás két transzlokálódó komplex ütközése után történik, a felismerési helyek közelében (III. típusú enzimek és McrBC) vagy azoktól távolabb (I. típusú enzimek) lévő véletlenszerű helyeken.
Noha a legtöbb II. típusú restrikciós enzim homodimer, amely a palindromos felismerési helyük egy példányával lép kölcsönhatásba, léteznek olyan altípusok, amelyek két hely együttműködését igénylik (áttekintve: Pingoud és Jeltsch, 1997). Amint arra S. Halford (Bristol, Egyesült Királyság) rámutatott, ez nemcsak a IIe típusú enzimek, mint a NaeI, hanem a IIf típusú enzimek, mint az SfiI, és az IIS típusú enzimek, mint a FokI esetében is így van. A IIf típusú enzimek homotetramerek, két különálló DNS-kötőhellyel, amelyeket két alegység alkot. Az SfiI csak akkor aktív, ha mindkét DNS-kötőhely foglalt, ami mindkét hely egyidejű hasításához vezet. A FokI esetében, amely egy hasító és egy felismerő doménből áll, korábban kimutatták, hogy az enzimnek a DNS-en történő dimerizációja szükséges a hasításhoz. Halford most kimutatta, hogy a hatékony hasításhoz két felismerőhelyre van szükség, mivel a felismerő domének mindegyikének kölcsönhatásba kell lépnie egy-egy felismerő szekvenciával. Mindhárom enzimtípus optimálisan két helyen, ugyanazon a DNS-en működik, ahol a DNS-t a helyek között egy hurokba zárják.
Attipikus II. típusú restrikciós enzimeket továbbra is felfedeznek. A BbvCI egy heterodimer restrikciós enzim, amely aszimmetrikus szekvenciát ismer fel. Az alegységek külön-külön inaktívak, de együtt aktívak. Ez lehetővé teszi specifikus nicking enzimek létrehozását az egyik alegység inaktiválásával, helyileg irányított mutagenezissel, amint arról G. Wilson (Beverly, MA) beszámolt. A. Janulaitis (Vilnius, Litvánia) hasonló eredményt kapott a heterodimer Bpu10I restrikciós enzim esetében. Sikerült lazítania az Eco57I, egy monomer restrikciós és módosító enzim szubsztrátspecifitását is, amely egyetlen célpontfelismerő doménnel rendelkezik. Ebben a tanulmányban random mutagenezissel olyan variánst hoztak létre, amely nemcsak a kanonikus CTGAAG-, hanem a CTGGAG-helyekkel is kölcsönhatásba lép. Ennek a lazább specificitásnak a molekuláris alapjait még meg kell határozni. V. Siksnys (Vilnius, Litvánia) egy új IIs típusú restrikciós enzim, a BfiI felfedezéséről számolt be, amely a hasításhoz nem függ a kétértékű fémionoktól. Ez az enzim szekvencia-hasonlóságot mutat a Salmonella typhimuriumból származó nem specifikus nukleázzal, és feltehetően hasonló katalitikus mechanizmust használ.
A. Pingoud (Giessen, Németország) a II-es típusú restrikciós enzimek és a homing endonukleázok DNS hasításának mechanizmusát tárgyalta, amelyeknek közös a funkciójuk, de általában eltérő szerkezetűek és feltehetően eltérő hasítási mechanizmusokat követnek. Annak ellenére, hogy számos, közös katalitikus motívummal rendelkező restrikciós enzimről részletes szerkezeti információ áll rendelkezésre, nincs konszenzus a katalitikus mechanizmust vagy a katalízisben részt vevő Mg2+ ionok számát illetően. Elvileg ugyanez igaz más, restrikciós enzimhez hasonló katalitikus centrummal rendelkező foszforil-transzferázokra is. Ilyen fehérjékre példa a Vsr repair enzim (E. coli) és a Hjc resolváz (Pyrococcus furiosus). Az utóbbi kristályszerkezetét K. Morikawa (Osaka, Japán) mutatta be (3. ábra).3). Ezzel szemben a HNH családba tartozó homing endonukleázok, pl. az I-PpoI által végzett DNS hasítás mechanizmusa jobban megalapozottnak tűnik, mivel szerkezeti információk állnak rendelkezésre a szabad enzimre, valamint az enzim-szubsztrát és enzim-termék komplexekre vonatkozóan, továbbá részletes biokémiai információk állnak rendelkezésre erre és a “ββα-Me finger” szupercsalád rokon enzimeire vonatkozóan. Ezek az enzimek kofaktorként Mg2+ iont igényelnek, amely egy konzervált Asn-hez kötődik. A támadó hidroxil-iont egy konzervált His hozza létre, az átmeneti állapot stabilizálásában egy konzervált Arg vesz részt, a távozó csoport protonálását pedig egy vízmolekula biztosítja a Mg2+ ion hidratációs szférájából.
3. ábra. A Hjc és a Vsr restrikciós endonukleázok hajtásainak összehasonlítása, mint példa a rokon funkciójú enzimek szerkezetének megőrzésére. A Hjc és a Vsr szalagdiagramjai a két szerkezet egymásra helyezése után azonos orientációban láthatók. Az aktív központ maradékainak oldalláncai ki vannak emelve, a két konzervált Asp-maradék pedig fel van tüntetve. Ezt az ábrát T. Nishino és K. Morikawa bocsátotta rendelkezésünkre.
A baktériumok RM rendszereket fejlesztettek ki a bakteriofágok elleni küzdelemre. Ezek viszont különböző eszközöket fejlesztettek ki a bakteriális RM-rendszerek általi korlátozás elkerülésére. D. Dryden (Edinburgh, Egyesült Királyság) beszámolt a T7 bakteriofág 0.3 génű fehérjéjének biokémiai elemzésének eredményeiről, amely az I. típusú restrikciós-módosító enzimek gátlója. Ez a fehérje sztöchiometrikusan kötődik a restrikciós enzimhez, és megnyúlt formája és negatív felületi töltése miatt feltehetően teljesen kitölti az enzim DNS-kötőhelyét, és ezáltal megakadályozza a DNS-kötést.
Az RM rendszerek restrikciós endonukleázokból és DNS-metiltranszferázokból (MTázok) állnak (áttekintés: Cheng, 1995; Robertson és Wolffe, 2000). Mivel azonban a DNS-metiláció mintázata információt ad a DNS-hez, és ezáltal bővíti annak kódolási kapacitását, a MTázok nemcsak a restrikciós enzimek társai az RM rendszerekben, hanem számos más létfontosságú funkcióval is rendelkeznek. Prokariótákban szerepet játszanak a DNS-javításban, valamint a génexpresszió és a DNS-replikáció szabályozásában. Eukariótákban a DNS-metiláció általában a gének transzkripciós elnémításához vezet. Hozzájárul az olyan epigenetikai folyamatokhoz, mint az X-kromoszóma inaktiválása, az imprinting és a génszabályozás. Azzal a felfedezéssel, hogy számos DNS MTáz nélkülözhetetlen az egerek fejlődéséhez, a DNS-metiláció fontossága széles körben elfogadottá vált.
X. Cheng (Atlanta, GA) bemutatta a Dnmt2 fehérje szerkezetét, amely az első eukarióta DNS MTáz szerkezete lehet. A fehérje MTáz folddal rendelkezik, és rendelkezik az összes jellegzetes katalitikus motívummal, de úgy tűnik, hogy nincs katalitikus aktivitása. Ez olyan kérdéseket vet fel, mint például, hogy valóban enzimről van-e szó, és hogy valójában mi a szubsztrátja (DNS, RNS vagy valami más). Cheng és A. Jeltsch (Giessen, Németország) eukarióta enzimekkel kapcsolatos további vitái a Dnmt1, Dnmt3a és Dnmt3b enzimekkel foglalkoztak. Mindkét előadó beszámolt e hatalmas (akár 1700 aminosavmaradékot is tartalmazó) enzimek csonka fehérjéivel és izolált doménjeivel kapott eredményekről, valamint a tisztított enzimek enzimatikai elemzésével kapcsolatos eredményekről. Mivel a Dnmt1 katalitikus doménje (∼500 aminosavmaradék) izolált formában nem aktív, az enzim más részeinek szoros ellenőrzése alatt kell állnia. Ez a kölcsönhatás szükséges lehet a hemimetilált DNS-re való nagyfokú specificitás biztosításához. A területen elért haladás ellenére a DNS-metiláció folyamata az eukariótákban, különösen a DNS-metilációs mintázatot létrehozó mechanizmusok még mindig kevéssé ismertek.
A prokarióták DNS-metilációjáról valamivel többet tudunk. R. Gumport (Urbana, IL) bemutatta a prokarióta M.RsrI MTáz szerkezetét, megerősítve azt a feltételezést, hogy az összes MTáz katalitikus doménje közös felépítésű. S. Klimasauskas (Vilnius, Litvánia), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport és Jeltsch négy prokarióta MTáz (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI és M.EcoRV) molekuláris enzimológiáját vitatták meg. Ezen enzimek katalitikus ciklusa magában foglalja a DNS- és kofaktor-kötést, a célterület megtalálását és felismerését, valamint a komplex konformációs változásait, beleértve a bázisfordítást és a metilcsoport-átadást (4. ábra).4). Részletes különbségek váltak nyilvánvalóvá; pl. a szubsztrát- és kofaktor-kötés sorrendje és a sebességet korlátozó lépés különbözik a különböző MTázoknál. A 2-aminopurin jó eszköznek bizonyult azon konformációs változások kinetikájának elemzésére, amelyeken a DNS MTázok komplexében megy keresztül, beleértve a bázisfordítást is.
4. ábra. A restrikciós endonukleázok és a DNS-metiltranszferázok által végzett célhelymeghatározás mechanizmusa. Először a DNS-t nem-specifikusan kötik meg, majd a célhelyet a DNS-en való könnyített diffúzió (csúszás és ugrálás) révén találják meg. A célhelyekkel való érintkezés az enzim és a DNS konformációs változásait idézi elő, amelyek viszont katalízist váltanak ki. Ez a mechanizmus a legtöbb, a DNS-sel specifikusan kölcsönhatásba lépő enzimre jellemző.