Differenziazione tra cinghiale e maiale domestico nell’alimentazione tramite due loci genici tramite PCR in tempo reale

Primer e disegno della sonda

Per il disegno del primer e della sonda, abbiamo selezionato polimorfismi che erano già stati riportati per permettere la discriminazione tra cinghiale e maiale domestico. Abbiamo iniziato con lo SNP g.299084751 C > T nel gene NR6A1, che è stato trovato associato al numero di vertebre toraciche e lombari: i cinghiali, che sono omozigoti per l’allele wild type g.299084751 C, hanno 19 vertebre, mentre i maiali domestici, che sono omozigoti per g.299084751 T, hanno 21-23 vertebre. Nello studio di Fontanesi et al., questo SNP è stato usato per discriminare il cinghiale e il maiale domestico tramite PCR-RFLP10. Abbiamo mirato a progettare una coppia di primer per l’amplificazione della regione target sia nel cinghiale che nel maiale domestico, e due sonde TaqMan, specifiche per l’allele del cinghiale (g.299084751 C) e l’allele del maiale domestico (g.299084751 T), rispettivamente. Il test duplex dovrebbe consentire di rilevare contemporaneamente il cinghiale e il maiale domestico in uno stesso pozzetto. In totale, abbiamo progettato quattro primer forward, tre primer reverse, quattro sonde di cinghiale e una sonda di maiale domestico e li abbiamo combinati in 21 sistemi primer/sonda (Chr1a – u, Tabella supplementare 1). Il sistema di primer/sonde Chr1a ha preso di mira il filamento superiore, i sistemi di primer/sonde Chr1b-u il filamento inferiore del gene NR6A1. In una serie di esperimenti, abbiamo indagato se i sistemi primer/sonda fossero specifici per il cinghiale o mostrassero una reattività incrociata con razze di maiali domestici/incrociate. Il sistema primer/sonda Chr1a ha prodotto un valore ΔCt ≥ 10,56 tra il maiale domestico e il cinghiale (tabella 2 supplementare). Per i sistemi primer/sonda Chr1i – o, i valori ΔCt variavano da 8,65 a 11,19. I sistemi primer/sonda Chr1b – h e Chr1p – t non hanno prodotto un aumento del segnale di fluorescenza per le razze di suini domestici/incroci. Poiché il sistema primer/sonda Chr1q ha dato come risultato il valore Ct più basso (24,77; n = 2) per il cinghiale, abbiamo testato la sua applicabilità in combinazione con una sonda TaqMan per il maiale domestico in formato duplex (sistema primer/sonda Chr1u, tabella 1 supplementare). Poiché i valori Ct sia per il cinghiale (26,21, n = 2) che per il maiale domestico (27,90, n = 2) erano soddisfacenti, tutti gli ulteriori esperimenti di PCR mirati allo SNP g.299084751 C > T sono stati eseguiti con il sistema primer/sonda Chr1u. Nel seguito, il saggio di PCR in tempo reale duplex è chiamato saggioChr1, composto dal saggio per il maiale domestico, saggioChr1D, che coinvolge il primer forward Chr1f4, primer inverso Chr1r2 e sonda Chr1p1D, e il saggio per il cinghiale, saggioChr1W, che coinvolge il primer forward Chr1f4, primer inverso Chr1r2 e sonda Chr1p4W (Fig. 1A).

Seguenze parziali di (A) il gene NR6A1 sul cromosoma 1 che porta SNP g.299084751 C > T, che ha come target il test duplex “assayChr1”, e (B) il cromosoma 9 che porta lo SNP g.118314929 A > G (rs81416363), che ha come target i due test singleplex “assayChr9D” e “assayChr9W”. Le frecce indicano le posizioni dei primer (grigio scuro) e delle sonde (grigio chiaro). (A) Il test DuplexChr1 includeva il primer forward Chr1f4, il primer reverse Chr1r2, la sonda Chr1p4W e la sonda Chr1p1D. (B) test singleplexChr9D incluso forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D e sonda Chr9p2; test singleplexChr9W incluso forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W e sonda Chr9p2. Le basi specifiche della sottospecie sono mostrate in grassetto (frecce verticali rosse) e le basi mismatch in blu (frecce verticali blu).

Siccome abbiamo imparato dalla letteratura che il potere di discriminazione puntando su un solo polimorfismo non è molto probabilmente sufficiente, abbiamo cercato un ulteriore locus genico adatto. Studiando 20 SNPs per la loro applicabilità per differenziare il cinghiale dal maiale domestico, Beugin et al. hanno trovato gli SNPs rs80864596 (intergenico, cromosoma 5), rs80796712 (glicogeno sintasi chinasi 3-beta, cromosoma 13) e rs81416363 (intergenico, cromosoma 9) per mostrare il più alto potere discriminatorio11. Abbiamo quindi selezionato questi tre SNPs per la progettazione di primer / sistemi di sonde. Rispetto alla progettazione primer/sonda per SNP g.299084751 C > T, abbiamo perseguito una strategia diversa. Invece di localizzare la base sottospecie-specifica nella sonda, l’abbiamo localizzata al penultimo sito dall’estremità 5′ del primer forward o reverse. Al fine di migliorare la specificità, abbiamo introdotto dei mismatch di base intenzionali. Questa cosiddetta tecnica del mismatch amplification mutation assay (MAMA)12,13 ha il vantaggio di essere piuttosto efficiente in termini di costi perché una stessa sonda può essere testata con un certo numero di primer che differiscono nella posizione del mismatch. Nella prima serie di esperimenti abbiamo introdotto la base del mismatch o alla terza o alla sesta posizione dall’estremità 3′ del primer che porta la base specifica della sottospecie. Quando avevamo sviluppato saggi PCR in tempo reale per il cervo rosso, il daino e il cervo sika, rispettivamente14,15,16, questa strategia si era rivelata vincente. Tuttavia, nel presente studio nessuno dei sistemi primer/sonde (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, Tabella supplementare 1) ha permesso la differenziazione tra maiale domestico e cinghiale (Tabella supplementare 3). I migliori risultati (valore ΔCt tra razze di suini domestici/incrociati e cinghiali ≥5,24) sono stati ottenuti con il sistema primer/sonda Chr9j. In questo sistema primer/sonda, che ha come target lo SNP rs81416363 sul cromosoma 9, la base di mismatch è stata localizzata nella terza posizione dall’estremità 3′ del primer (TTCACG → TTCCCG). Per aumentare la specificità, abbiamo introdotto un ulteriore mismatch nella quarta (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) o quinta posizione (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) dalla fine 3′ del primer. L’introduzione di ulteriori mismatch si è rivelata un successo. Con il sistema primer/sonda Chr9r (Tabella supplementare 1) abbiamo ottenuto sia il valore Ct più basso per il cinghiale (22,09; n = 2) che il più alto valore ΔCt (10,52) tra le razze di maiali domestici/incroci e il cinghiale (Tabella supplementare 3). Questo test di PCR in tempo reale per il cinghiale, mirato allo SNP rs81416363 situato sul cromosoma 9, era basato sul sistema primer/sonda Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

In seguito, abbiamo applicato la strategia MAMA per sviluppare il corrispondente saggio di PCR in tempo reale, mirato allo SNP rs81416363 situato sul cromosoma 9, per il maiale domestico. Abbiamo localizzato la base specifica del maiale domestico alla penultima base dall’estremità 5′ del primer e la base del mismatch alla terza posizione dall’estremità 3′ (sistemi primer/sonda Chr9v – x; Tabella 1 supplementare). Tuttavia, l’introduzione di una base mismatch non era sufficiente per consentire la differenziazione del maiale domestico e del cinghiale. L’introduzione di basi mismatch alla 3a e 5a posizione dall’estremità 3′ del primer (sistemi primer/probe Chr9y – ag) ha portato a un valore ΔCt ≥ 4,83. Quando i mismatch erano nelle posizioni 3 e 4 (sistemi primer/sonde Chr9ah – aj), il valore ΔCt era ≥ 5,85. Introducendo tre basi consecutive di mismatch accanto alla base specifica della sottospecie (sistemi primer/sonda Chr9ak – am), la specificità poteva essere aumentata. Il sistema primer/sonda Chr9ak, in cui i mismatch erano in posizione 3, 4 e 5 (TTCATG → TGGTTG) ha portato al più alto valore ΔCt di ≥9,97. Così, tutti gli ulteriori esperimenti sono stati eseguiti con il sistema primer/sonda Chr9ak. Nel seguito, i due saggi singleplex che hanno come obiettivo lo SNP rs81416363 sul cromosoma 9 sono indicati come assayChr9D, tra cui forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D e sonda Chr9p2, e assayChr9W, tra forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W e sonda Chr9p2 (Fig. 1B).

Ottimizzazione della concentrazione e del rapporto primer/sonda

Tutti i risultati presentati sopra sono stati ottenuti con concentrazioni di primer e sonda di 500 nM e 200 nM (sistemi primer/sonda per il cromosoma 1), e 200 nM e 100 nM (sistemi primer/sonda per i cromosomi 5, 9 e 13), rispettivamente. Successivamente, abbiamo studiato se la specificità dei saggi PCR in tempo reale potesse essere aumentata ottimizzando la concentrazione e il rapporto primer/sonda. Nel caso del testChr1, le concentrazioni ottimali di primer e sonda sono risultate essere 1.000 nM e 200 nM, rispettivamente (Tabella 4 supplementare). Nel caso di assayChr9W e assayChr9D, un’eccedenza del primer che porta sia la base sottospecie-specifica che le basi di mismatch ha portato a valori ΔCt più alti tra la sottospecie che reagisce in modo incrociato e la specie bersaglio. La più alta selettività di assayChr9W e assayChr9D è stata raggiunta con concentrazioni di forward primer/reverse primer/probe di 12,5/200/50 nM e 62,5/800/50 nM, rispettivamente.

Test di cross-reattività

In seguito, abbiamo eseguito test di cross-reattività con DNA isolato da cinghiali, varie razze di maiali domestici/incroci e altre 22 specie animali elencate nella tabella supplementare 5. La Figura 2A-D mostra le curve di amplificazione ottenute con il testChr9W, il testChr9D, il testChr1W e il testChr1D, rispettivamente. Il saggioChr9W ha mostrato una leggera cross-reattività con maiali domestici, cervi sika, stambecchi alpini, pecore, capre e camosci (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), il saggioChr9D con cinghiali, cervi sika, alci, cavalli e tacchini (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). In contrasto con i saggi che mirano allo SNP rs81416363 sul cromosoma 9, il saggioChr1 non ha mostrato alcuna cross-reattività (con l’eccezione del saggioChr1W per il capriolo in una sola replica su quattro). Abbiamo anche analizzato il DNA isolato da 50 specie di piante comunemente usate come ingredienti alimentari (Tabella 6 supplementare). Nessuno dei saggi ha mostrato cross-reattività con nessuna delle specie vegetali.

Risultati ottenuti eseguendo test di cross-reattività con DNA isolato (10 ng/µL) da 22 specie animali e cinghiale/maiale domestico. (A) testChr9W, (B) testChr9D, (C) testChr1W e (D) testChr1D.

Screening vari master mix commerciali per la loro applicabilità

In una successiva serie di esperimenti, abbiamo studiato se il tipo di master mix commerciale influenzasse la selettività dei test. Abbiamo analizzato il DNA isolato da 23 specie animali tra cui 3 individui di cinghiale e 11 razze/incroci di maiale domestico con un totale di cinque master mix di diversi fornitori. Le master mix e i rispettivi programmi di temperatura sono riportati nella tabella supplementare 7. In generale, il tipo di master mix ha influenzato sia i valori Ct assoluti che i valori ΔCt tra il target e le (sotto)specie cross-reagenti. Tuttavia, i saggi PCR in tempo reale sono stati influenzati in misura diversa. Nel caso del testChr9W, per esempio, le miscele 2 e 3 hanno portato a valori Ct più alti rispetto alla miscela master 1 (la miscela master standard nel presente studio), 4 e 5 (Ct ± SD (n = 6): miscela 1: 25,03 ± 0,15; miscela 2: 31,17 ± 1,70; miscela 3: 28,43 ± 0,13; miscela 4: 26,64 ± 0,10; miscela 5: 26,64 ± 0,17). Nel caso del testChr9D, il tipo di master mix ha avuto un’influenza sui valori ΔCt e quindi sulla selettività del test. I valori ΔCt ottenuti con master mix 1, 2, 3 e 4 erano ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 e ≥ 5,86, rispettivamente, mentre con master mix 5, non è stata osservata alcuna reattività incrociata. Nel caso del testChr1, valori Ct piuttosto simili sono stati ottenuti con master mix 1, 3 e 4. Tuttavia, le master mix 2 e 5 non hanno portato alla formazione di alcun prodotto, molto probabilmente perché queste mix non sono adatte al multiplexing. Sulla base di questi risultati, si consiglia vivamente di testare l’applicabilità se un altro tipo di master mix è destinato ad essere utilizzato.

Robustezza

La robustezza dei saggi PCR in tempo reale è stata studiata variando la temperatura di annealing ±1 °C e il volume della miscela di reazione per pozzetto di ±5% e applicando due diversi ciclatori PCR in tempo reale. Gli esperimenti sono stati eseguiti con DNA isolato da cinghiale, maiale domestico e capriolo. Per il saggioChr9W e il saggioChr9D, i valori Ct erano molto simili a quelli ottenuti in condizioni standard (valori ΔCt <1,00) tranne quando la temperatura di annealing è stata aumentata a 61 °C (valori ΔCt ≤2,16 e ≤1,57, rispettivamente). Con valori ΔCt ≤0,77, il testChr1 si è rivelato ancora più robusto. Né il ridimensionamento del volume di reazione totale né l’uso di un altro ciclatore di PCR in tempo reale hanno sostanzialmente influenzato i valori Ct, dimostrando la robustezza dei saggi di PCR in tempo reale.

Campo di lavoro, intervallo lineare ed efficienza di amplificazione

Analizzando un isolato di DNA di cinghiale (211 µg/mL) e due isolati di DNA di maiale domestico (158 µg/mL e 160 µg/mL) diluiti in serie in acqua (1:2-1:524.288), il saggioChr9W, il saggioChr9D, il saggioChr1W e il saggioChr1D erano lineari tra 211 µg/mL e 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL e 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL e 6 ng/mL (R2 = 0,9994) e 160 µg/mL e 10 ng/mL (R2 = 0,9988), rispettivamente (Fig. 3A). Le efficienze di amplificazione calcolate dalle pendenze delle curve standard erano 83%, 96%, 93% e 95%, rispettivamente. Inoltre, l’intervallo di linearità è stato valutato analizzando isolati di DNA di cinghiale e di maiale domestico diluiti in serie in DNA di sperma di aringa. Per il saggioChr9W e il saggioChr9D, la linearità andava da 20 µg/mL a 20 ng/mL (R2 = 0,9988) e da 20 µg/mL a 39 ng/mL (R2 = 0,9985), rispettivamente (Fig. 3B). Nel caso del saggioChr1W e del saggioChr1D, la linearità era nell’intervallo da 20 µg/mL a 5 ng/mL (R2 = 0,9978) e da 20 µg/mL a 10 ng/mL (R2 = 0,9988), rispettivamente. Le efficienze di amplificazione calcolate dalle pendenze delle curve standard erano 76%, 90%, 97% e 101%, rispettivamente.

Range di linearità dei quattro saggi, (A) determinato in acqua come sfondo e (B) determinato nel DNA di sperma di aringa come DNA di sfondo non bersaglio.

Questi risultati indicano che l’intervallo di lavoro dei saggi PCR in tempo reale è quasi identico, mentre l’intervallo di linearità è più stretto per i saggi rivolti al cromosoma 9 che per quelli rivolti al cromosoma 1. Tutte le efficienze di amplificazione erano comprese tra il 90% e il 110%, come raccomandato dalle linee guida ENGL17, ad eccezione del testChr9W (83% in acqua, 76% nel DNA di sperma di aringa). La minore efficienza di amplificazione del testChr9W è molto probabilmente causata da una minore stabilità di legame del primer a causa dei mismatch, introdotti per aumentare la selettività per le specie animali bersaglio.

Limit of detection (LOD) nel DNA di sperma di aringa e nel DNA di maiale come DNA di fondo

Il LOD è stato definito come la più bassa concentrazione di DNA che ha portato a un aumento del segnale di fluorescenza in almeno 19 su 20 replicati. Inoltre, il valore Ct dovrebbe essere inferiore al valore Ct ottenuto per le specie a reazione incrociata.

Nel DNA di sperma di aringa, il LOD del testChr9D (1,0%, w/w, Fig. 4A) era leggermente superiore al LOD degli altri tre saggi (0,2%, w/w, Fig. 4B-D). Il LOD più alto del saggioChr9D è causato dalla reattività incrociata con il cinghiale (valore ΔCt tra cinghiale e maiale domestico solo ≥8,41).

Determinazione del LOD analizzando diluizioni seriali di (A-D) miscele di DNA contenenti DNA di cinghiale o maiale domestico in DNA di sperma di aringa e (E-H) una miscela di DNA contenente DNA di cinghiale in DNA di maiale domestico o DNA di maiale domestico in DNA di cinghiale come DNA di fondo. (A,E) sono stati ottenuti usando il testChr9D, (B,F) usando il testChr9W, (C,G) usando il testChr1D e (D,H) usando il testChr1W. Le misurazioni sono state effettuate in 20 repliche. I cerchi rappresentano i valori Ct individuali, le linee orizzontali indicano i valori medi.

Inoltre, abbiamo determinato il LOD dei saggi PCR in tempo reale per il cinghiale, assayChr1W e assayChr9W, nel DNA di maiale domestico come sfondo, e quello dei saggi per il maiale domestico, assayChr1D e assayChr9D, nel DNA di cinghiale come sfondo. Con il 2%, 0,2%, 5% e 2% (p/p), i LOD del saggioChr9D (Fig. 4E), del saggioChr9W (Fig. 4F), del saggioChr1D (Fig. 4G) e del saggioChr1W (Fig. 4H) erano piuttosto diversi. Il LOD più alto del saggioChr1D in presenza di DNA di cinghiale è stato causato dalla soppressione del segnale, molto probabilmente a causa della competizione delle due sonde per la sequenza bersaglio nel formato del saggio duplex. Per indagare più in dettaglio la soppressione del segnale, sono state analizzate miscele di DNA contenenti il 25% (p/p) di DNA di cinghiale in DNA di maiale domestico o il 25% (p/p) di DNA di maiale domestico in DNA di cinghiale, oltre ai controlli positivi (DNA di cinghiale e DNA di maiale domestico, rispettivamente).

Quando abbiamo confrontato i controlli positivi con gli standard diluiti 1:4 contenenti DNA non bersaglio, non abbiamo trovato una differenza nelle curve di amplificazione (valori ΔRn) per il saggioChr9W e il saggioChr9D (Fig. 5A,B). Tuttavia, nel caso del saggioChr1W e del saggioChr1D, i segnali di fluorescenza (valori ΔRn) ottenuti per il controllo positivo erano superiori a quelli ottenuti per lo standard diluito 1:4 alla stessa concentrazione di DNA bersaglio (Fig. 5C,D).

Curve di amplificazione (in semi log view) ottenute per miscele di DNA (20 ng/µL) contenenti il 25% (w/w) della sottospecie target (cinghiale o maiale domestico) e il 75% (w/w) della sottospecie non target (cinghiale o maiale domestico) e loro diluizioni seriali (1:4 a 1:1.024). I DNA isolati (5 ng/µL) dal cinghiale e dal maiale domestico, rispettivamente, sono stati usati come controlli. Il testChr9W (A) e il testChr9D (B) mostrano una reattività incrociata con la sottospecie non bersaglio. Il testChr1W (C) e il testChr1D (D) mostrano la soppressione del segnale in presenza di sottospecie non bersaglio.

Ripetibilità

La ripetibilità dei test PCR in tempo reale è stata studiata analizzando miscele di estratti di carne contenenti il 30% (w/w) di DNA bersaglio e il 70% (w/w) di DNA di sottospecie non bersaglio, nonché diluizioni seriali, in duplicati per cinque volte in quattro giorni diversi. La RSD dei valori Ct era ≤1,0% (testChr1W), ≤1,9% (testChr9W), ≤2,3% (testChr1D) e ≤3,5% (testChr9D), dimostrando l’alta ripetibilità dei test.

Analisi di campioni da individui di cinghiale e maiale domestico

I saggi di PCR in tempo reale sono stati applicati all’analisi di campioni da 64 individui di maiale domestico, tra cui 14 razze e 6 incroci (Fig. 6A). Inoltre, abbiamo analizzato un totale di 30 campioni di cinghiale provenienti da 5 paesi diversi (Austria, Estonia, Germania, Romania e USA, Fig. 6B). Nel caso di un individuo di cinghiale dall’Europa, l’origine esatta era sconosciuta. Ogni campione è stato analizzato in almeno quattro repliche. Ad ogni piastra PCR è stato aggiunto un controllo positivo (miscela di DNA, 10 ng/µL) contenente la sottospecie target nella stessa concentrazione del LOD, fornendo il valore Ct di cut-off.

Risultati ottenuti per (A) 64 campioni di suino domestico e (B) 30 di cinghiale. Le misurazioni sono state effettuate in almeno quattro repliche.

Quando abbiamo analizzato i controlli positivi in 14 repliche, la media ± SD dei valori Ct era 33,85 ± 0,93 (saggioChr9W), 35,19 ± 1,11 (saggioChr9D), 32,89 ± 0,28 (saggioChr1W) e 32,60 ± 0,47 (saggioChr1D). Con l’eccezione del testChr9D, tutti i campioni con valori Ct più alti sono stati considerati <LOD. Nel caso del saggioChr9D, per diversi campioni di cinghiale sono stati ottenuti valori Ct ≥ 34,61. Al fine di ridurre la probabilità di risultati falsi positivi, abbiamo impostato il valore Ct di cut-off del testChr9D a 34,00. Per l’applicazione di assayChr9W e assayChr9D nelle analisi di routine, si consiglia di utilizzare un controllo positivo composto dal 2% (w/w) di DNA di maiale domestico, 0.2% (w/w) di DNA di cinghiale e 97.8% (w/w) di DNA di sperma di aringa.

Per l’analisi di campioni di maiale domestico con assayChr9D, abbiamo ottenuto 63 risultati positivi e solo uno negativo (Mangalica 1) (Fig. 6). Dei 12 individui di Cinta Senese, abbiamo analizzato due diverse parti di carne, un campione magro (da longissimus dorsi) e un campione di grasso sottocutaneo posteriore (da lombo) (dati non mostrati). I valori Ct ottenuti per i campioni magri (Ct medio ± SD di 25,24 ± 0,44, n = 48) erano molto simili a quelli dei campioni di grasso dorsale sottocutaneo (26,29 ± 0,35, n = 48). Quando abbiamo analizzato i 30 campioni di cinghiale con il saggioChr9D, 21 non hanno prodotto un aumento del segnale di fluorescenza, ma nove individui (uno dall’Austria, cinque dalla Germania e tre dagli USA) sono stati identificati come maiale domestico.

Con il saggioChr9W, la maggioranza dei campioni di cinghiale è stata assegnata correttamente, solo per tre campioni (uno dalla Germania e due dagli USA) abbiamo ottenuto risultati negativi. Tuttavia, il testChr9W ha portato a risultati positivi anche per alcuni individui di maiale domestico, tra cui un Bentheim Black Pied, tre Krškopolje e tre Mangalica. In particolare, i tre maiali Mangalica provenienti dall’Austria sono stati identificati come maiali domestici, mentre i tre individui provenienti dalla Germania sono stati identificati come cinghiali. Nel caso del testChr9, compresi il testChr9W e il testChr9D, 12 dei 94 campioni di carne hanno portato a risultati ambigui, perché un aumento del segnale di fluorescenza è stato ottenuto con entrambi i test PCR in tempo reale. Inoltre, un individuo di maiale Mangalica è stato identificato come cinghiale e tre individui di cinghiale come maiale domestico.

Nello studio di Beugin et al.11 l’idoneità dello SNP rs81416363 era stata testata su cinghiali “puri” cacciati in un parco naturale nei Vosgi in Francia e un numero limitato di razze di maiali commerciali (Landrace, Large White, Piétrain e Duroc). I cinghiali sono risultati portatori dell’allele G (frequenza 100%, nessuna eterozigosi), i maiali domestici dell’allele A (frequenza 98%, eterozigosi 5%).

Per scoprire perché il saggioChr9W e il saggioChr9D hanno portato a diverse classificazioni errate e ad alcuni risultati ambigui, abbiamo genotipizzato i rispettivi campioni di cinghiale e di maiale domestico mediante analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM). Abbiamo applicato l’analisi HRM perché è una tecnica potente, tempo e costo-efficiente per genotipizzazione SNP18. Le curve di fusione normalizzate (Fig. 7A) indicano che il genotipo G omozigote è stato trovato non solo per i campioni di cinghiale, ma anche per il campione Mangalica (campione 1) per il quale è stato ottenuto un aumento del segnale di fluorescenza con il saggioChr9W ma non con il saggioChr9D. I campioni di cinghiale che hanno ottenuto un aumento del segnale di fluorescenza con il testChr9D sono risultati portatori di almeno una copia dell’allele A. Quattro individui di cinghiale hanno mostrato il genotipo eterozigote, cinque erano omozigoti per l’allele A. Inoltre, cinque individui di maiale domestico, compresi tre individui di Krškopolje dalla Slovenia, sono risultati portatori di entrambi gli alleli A e G. Quindi, con la genotipizzazione HRM abbiamo potuto verificare che i risultati ottenuti con il testChr9W e il testChr9D erano in accordo con i rispettivi genotipi degli individui. Tuttavia, i nostri risultati indicano che i due saggi singleplex mirati allo SNP rs81416363, assayChr9W e assayChr9D, non permettono la discriminazione univoca di cinghiale e maiale domestico.

Curve HRM normalizzate per (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) sul cromosoma 9 per omozigoti G (cinghiale), omozigoti A (maiale domestico) e eterozigoti A + G e (B) SNP g.299084751 C > T sul cromosoma 1 per l’omozigote C (cinghiale), l’omozigote T (maiale domestico) e l’eterozigote C + T.

Con il saggioChr1D, tutti i campioni di maiale domestico tranne tre sono stati classificati come maiale domestico (Fig. 6). Con il saggioChr9D, i valori Ct ottenuti per i campioni di grasso dorsale magro e sottocutaneo dei 12 individui di Cinta Senese erano molto simili (Ct medio ± SD di 25,99 ± 0,25 (n = 48) e 26,36 ± 0,25 (n = 48), rispettivamente). Tuttavia, con il saggioChr1D anche cinque dei 30 campioni di cinghiale sono stati identificati come maiale domestico. L’analisi dei campioni di cinghiale con il saggioChr1W ha portato a un solo risultato negativo. Tuttavia, anche un campione di Mangalica e sei individui di Turopolje hanno portato ad un aumento del segnale di fluorescenza con il saggioChr1W.

Nello studio di Fontanesi et al.10 lo SNP g.299084751 C > T era stato genotipizzato analizzando campioni di 293 suini domestici di cinque razze commerciali (Large White italiana, Landrace italiana, Duroc italiana, Landrace belga e Piétrain) e 201 cinghiali provenienti dall’Europa centro-meridionale (Italia settentrionale) e sud-orientale (Slovenia e regioni balcaniche occidentali). Fontanesi et al. hanno trovato tutti gli individui di maiale domestico omozigoti per l’allele T. Il 7,5% degli individui di cinghiale portava almeno una copia dell’allele T, con individui dell’Europa sud-orientale più frequentemente (12,2%) rispetto agli individui dell’Europa centro-meridionale (3,6%). L’11,1% dei cinghiali dell’Europa sudorientale erano del genotipo eterozigote C/T.

Quando abbiamo genotipizzato gli individui di cinghiale e di maiale domestico per lo SNP g.299084751 C > T mediante analisi HRM, abbiamo anche rilevato l’allele T non solo nei maiali domestici ma anche in alcuni cinghiali (Fig. 7B). L’individuo di cinghiale degli Stati Uniti ha mostrato il genotipo omozigote T, mentre l’individuo di cinghiale della Bassa Austria ha portato sia l’allele C che l’allele T. La maggior parte degli individui di cinghiale era comunque omozigote per l’allele C. Questo risultato indica che l’aumento del segnale di fluorescenza per tre campioni di cinghiale (Germania Bad Kissingen e Perleberg, e Europa) ottenuto con il testChr1D non era in accordo con il loro genotipo e quindi causato dalla cross-reattività. La maggior parte degli individui di maiale domestico è risultata omozigote per l’allele T. Tuttavia, sei degli otto individui di Turopolje sono risultati mostrare il genotipo eterozigote C/T, spiegando perché un aumento del segnale di fluorescenza è stato ottenuto sia con il testChr1D che con il testChr1W. L’alta frequenza del genotipo eterozigote C/T nel Turopolje, una razza di maiale domestico della Croazia, è in accordo con un documento molto recente del gruppo di ricerca di Fontanesi. Genotipizzando 47 individui di Turopolje, la frequenza dell’allele T e dell’allele C è stata riportata allo 0,57 e allo 0,43, rispettivamente19.

I nostri risultati dimostrano che né i due saggi singleplex mirati allo SNP rs81416363 né il saggio duplex mirato allo SNP g.299084751 C > T da soli permettono la discriminazione univoca di cinghiale e maiale domestico. Tuttavia, prendendo in considerazione i risultati dei due test singleplex e del test duplex, il potere di discriminazione può essere drasticamente aumentato. I nostri risultati dimostrano che se i due saggi per la stessa sottospecie (ad esempio il saggioChr9D e il saggioChr1D) portano alla stessa classificazione (nell’esempio dato maiale domestico), e i risultati ottenuti con i due saggi per le altre sottospecie (nell’esempio dato saggioChr9W e saggioChr1W) sono ambigui, la probabilità di errore di classificazione è bassa se si fa affidamento sui risultati che sono identici. Seguendo questa strategia, 86 (91,5%) dei 94 individui hanno potuto essere assegnati correttamente.