5.5.9 トリカルボン酸サイクル
ピルビン酸はTCAサイクルにおける酸化的グルコース代謝とC3前駆体からのグルコン生成経路の異化配列の分岐点に存在します。 両経路ともピルビン酸はTCAサイクルに入り、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを介してアセチル-CoAに酸化的に脱炭酸されるか、ピルビン酸カルボキシラーゼ反応によりオキサロ酢酸にカルボキシル化される。 PCとPDHはピルビン酸を取り合うので、それぞれ無補給代謝と酸化的代謝の調節に重要な位置にある。 Cohenら（1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c）は、標識および非標識のアラニンまたはピルビン酸、およびエタノールを組み合わせて用い、灌流ラットおよびマウス肝臓の種々のホルモンおよび食事状態におけるTCAサイクルへの移行に関する肝基質競合を調査している。
アラニンが唯一の肝基質であるとき、グルタミン酸とグルタミンのC2、C3、C4は、TCAサイクルのトポロジーから予想されるように容易に標識された（Cohen et al, 1979b; Cohen, 1987a）。 アラニンはピルビン酸に転化され、アセチル-CoAに脱炭酸されるか、オキサロ酢酸にカルボキシル化される。 このアセチルCoAはクエン酸に、さらにα-ケトグルタレートに変換され、グルタミン酸に変換される。 一方、オキサロ酢酸はリンゴ酸やフマル酸と平衡状態にあり（5.5.8項参照）、ラベルはオキサロ酢酸のC2およびC3にスクランブルされる。 このようなオキサロ酢酸の同位体がクエン酸合成酵素反応においてアセチルCoAと縮合すると、-とα-ケトグルタル酸、ひいては-とグルタミン酸が生成される。 したがって、PCとPDHを経由してTCAサイクルに入るピルビン酸の相対的割合は、グルタミン酸C2とC4の相対的濃縮度から推定することができる。 TCAサイクルの1回転のみを考慮し、ラベルの連続的なリサイクルを無視した1次モデルの仮定（セクション5.3.7参照）の下、Cohen (1983, 1987c) はPC対PDHフラックスレートの比を、よく肥えたラット、糖尿病ラット、24時間絶食ドナーの肝臓でそれぞれ1.2〜2.6および7.7と計算している。 糖尿病肝では、2つの経路を経てTCAサイクルに導かれるピルビン酸の相対的割合は、インスリンとのin vitro培養によって変化しなかった。
アラニンが肝代謝の唯一の基質である実験とは対照的に、非標識エタノールの共存により、グルタミン酸C4とグルタミンC4には本質的にラベルがなかった（Cohenら、1979b）。 エタノールはアルコールデヒドロゲナーゼによって容易にアセトアルデヒドに酸化され、さらに酢酸に酸化されるため、アセチルCoAの追加供給源として機能する。 その結果、エタノール由来のアセチル-CoAは、PDHを経由してTCAサイクルに入るアセチル-CoAと効率的に競合することが示された。 このように、アセチル-CoAの代替源が存在する場合、アラニンはほぼPC反応を経由してTCAサイクルに入ることがわかった。 さらに、アラニンとエタノールの共供給は、アラニン単独で灌流した肝臓と比較して、PC反応によるアラニンの消費速度をほぼ50％増加させた。 この結果は、PC反応がアセチルCoAの量によって制御されていることを考えると、予想外のことではなかった。 エタノールの代謝で得られるような高濃度のアセチルCoAは、TCAサイクルでアセチルCoAを加速的に消費するためにオキサロ酢酸プールを増やすためにPCを通過するフラックスを増加させたのであろう。 標識ピルビン酸＋NH4C1やエタノールを基質とした同様の実験も行われ、同等の結果が得られた (Cohen, 1987a,b). さらに、Nedelecら（1990b）は、Cohen（1983）が提案したモデルを用いて、ウイルスによる骨髄増殖性白血病が肝代謝に及ぼす影響を評価した。 絶食させたドナーの感染肝臓のアラニン代謝は、絶食させたコントロールと同様であることが分かった。 両群の肝臓は、絶食させた対照群と比較して、TCAサイクルへのアラニンのフラックスに対するPCとPDHの寄与が減少していた。 白血病の絶食肝におけるPC/PDHフラックスの比率の変化は、これらの臓器におけるトリグリセリド、ひいてはアセチル-CoAの利用可能性が劇的に低下したことによって説明された
13C MRSは、エタノールとアラニンの代謝を同時に追跡できる独自の可能性を秘めている（図8を参照）。 アラニンとエタノールを炭素源として用いた実験では、2つの異なる標識パターンを持つアセチル-CoAが生成された (Cohen, 1987b)。 アラニンがPDH反応によりTCAサイクルに入る際に、アセチル-CoAが生成され、エタノールからアセチル-CoAが得られる。 クエン酸、α-ケトグルタル酸、グルタミン酸、グルタミンのC4とC5の位置を標識することに加え、アセチルCoAの取り込みにより、グルタミン酸とグルタミンの隣接する炭素のC4とC5間に典型的なスピンカップリングが生じて、アラニンの取り込みにより生じた一重項共鳴と容易に区別されるようになる。 したがって、アラニンとエタノールの競合は、グルタミン酸のC4における一重項と多重項の比率の分析から直接推定することができる。 スピン結合パターンの解析は、灌流肝臓から得られた13C MRスペクトルで観測されたグルタチオンからの共鳴の割り当てにも有用であった（Cohen, 1987a）。 13C標識前駆体を肝臓に灌流した際にグルタチオン中のグルタミル部位に検出されたスピン結合パターンは、グルタミン酸に観察された標識パターンに密接に対応していた。 従って、グルタミン酸の炭素骨格は無傷のまま、de novo 合成されたグルタチオンに直接取り込まれると結論された。 肝臓のPCA抽出液で測定された化学シフトは、グルタチオンが還元型で存在することを示していた。
グルタミン酸とは別に、肝臓のグルタミンの標識も多くの実験で観察された。 これは、グルタミンはグルタミン合成酵素反応で容易に生成されるため、驚くには当たらない。 Cohenら（1979b）は、アラニン、標識または非標識エタノール存在下で灌流したマウス肝臓の肝グルタメートとグルタミンへの標識の取り込みの時間経過を追跡した。 調べたすべての条件下で、グルタミン酸とグルタミンそれぞれの13C MR信号強度の比C4/C2によって証明されるように、グルタミンの濃縮はグルタミン酸の濃縮に比べ遅れていることがわかった。 ある時刻にグルタミンで観測されたC4/C2比は、対応するグルタミン酸の比と同じではなく、約1時間前のグルタミン酸の比を反映したものであった。 この時間差は、生体内でアロステリックに制御されたグルタミン合成酵素反応を通過するフラックスの指標として用いられた。 同様の結果が、酢酸で灌流したラット肝臓から得られた（Desmoulinら、1985年；Canioniら、1985年）。 しかし、グルタミン酸とグルタミンにおける標識の解釈は、もう一歩踏み込んで行われた。 著者らは、グルタミン酸とグルタミンは、細胞質グルタミン合成酵素、ミトコンドリアグルタミナーゼ、およびミトコンドリア膜を介したグルタミン酸／グルタミン交換の活動からなる無益サイクルに参加している可能性を示唆した。
アラニンとエタノールまたはピルビン酸、塩化アンモニウムとエタノールで灌流した絶食肝臓では、C2とC3で標識されたアスパラギン酸とN-カルバモイルアスパラギン酸が観察できた（Cohen, 1987a）。 アスパラギン酸はTCAサイクルの中間体であるオキサロ酢酸の転移によって容易に生成するため、標識されたアスパラギン酸の検出は予想外ではなかった。 しかし、N-カルバモヤスパラギン酸は肝臓でde novoピリミジンヌクレオチド合成の最初のステップの1つで生成されたものである。 N-カルバモヤスパラギン酸は無傷のアスパラギン酸部分を取り込むため、観察される標識パターンにつながる。 さらに、ウリジンやそのリン酸化物などの経路の最終生成物から13Cラベルが検出されたことから、灌流肝臓において、ターンオーバーとは対照的に、N-カルバモイルラスパルテン酸の純合成が観察された（Cohen, 1987a）
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