Common ancestry of heterodimerizing TALE homeobox transcription factors across Metazoa and Archaeplastida

TALEs in Archaeplastida zijn onderverdeeld in twee groepen, KNOX en niet-KNOX

Om alle beschikbare homeobox eiwitsequenties te verzamelen, hebben we BLAST en Pfam-motif searches uitgevoerd tegen niet-plant genoom en transcriptoom assemblages in de Archaeplastida, waarbij 338 eiwitten van 56 soorten werden geïdentificeerd als de Archaeplastida homeobox collectie (30 genomen en 18 transcriptomen; Extra bestand 1: Tabel S1). Hiervan bezaten er 104 het kenmerk dat kenmerkend is voor TALE eiwitten, een drie-amino-acid invoeging tussen aa posities 23-24 in het homeodomain. Ten minste twee TALE genen werden gedetecteerd in de meeste genomen behalve vijf genomen in de Trebouxiophyceae klasse van de Chlorophyta (Additional file 1: Tabel S1; zie Additional file 2: Noot S1 voor verdere discussie over de afwezigheid van TALEs in Trebouxiophyceae).

De verzamelde TALE sequenties werden vervolgens geclassificeerd op basis van hun homeodomain kenmerken met behulp van een fylogenetische benadering, met TALEs van dieren, planten, en vroeg-divergerende eukaryoten (Amoebozoa en Excavata) als outgroups (Additional file 3: Figuur S1). De resulterende TALE homeodomain fylogenie onderscheidde twee groepen in alle drie de fyla van Archaeplastida (Fig. 2). (1) De KNOX-groep als een goed ondersteunde clade vertoonde een fylum-specifiek cladogram: twee Glaucophyta sequenties aan de basis (als KNOX-Glauco) waren gescheiden van de volgende clade, die Rhodophyta sequenties combineert (als KNOX-Red1) en een Viridiplantae-specifieke clade met sterke ondersteuning (92/90/1.00). (2) De niet-KNOX groep, inclusief de BELL en GSP1 homologs, bevatte clades van gemengde taxonomische verwantschappen. Deze analyses toonden aan dat de TALE proteïnen reeds vóór de evolutie van de Archaeplastida in twee groepen waren uiteengevallen en dat de KNOX-groep sterk geconserveerd is doorheen de Archaeplastida.

Maximum likelihood (ML) fylogenie van de TALE superklasse homeodomain in Archaeplastida ondersteunt oude verdeling tussen KNOX- en niet-KNOX TALE groepen. De ML bomen werden gegenereerd uit de homeodomain uitlijning met 70 aminozuurposities. De consensusboom uit 1000 bootstrap bomen wordt getoond. De drie getallen bij de kritische knooppunten geven %bootstrap, %SH, en Bayesiaanse posterior waarschijnlijkheid ter ondersteuning van de clades weer. De boom bevat twee outgroup clades, gemarkeerd door zwarte vierkantjes op de knooppunten, en twee Archaeplastida clades, één die de meeste KNOX sequenties combineert, gemarkeerd door het rode vierkantje, en de andere die alle niet-KNOX sequenties combineert, gemarkeerd door het blauwe vierkantje. Verticale balken rechts tonen de verdeling van de outgroup in zwart, KNOX in rood, en niet-KNOX sequenties in blauw. Rode stippen bij de sequentienamen duiden op de aanwezigheid van KN-A of KN-B domeinen, en blauwe stippen op de aanwezigheid van een PBC-homologie domein. Afgeknotte sequenties die niet beschikbaar zijn voor homologie domein analyse zijn gemarkeerd met open zwarte vakjes. Gevulde zwarte vakjes wijzen op de afwezigheid van een KN-A/B- of PBC-homologiedomein. De voorgestelde classificatie wordt aangegeven door de verticale lijnen. Gestippelde verticale lijnen geven voorgestelde klasseleden aan die in de fylogenie buiten de hoofdclade voor de klasse zijn geplaatst. PBX-Red sequenties worden gevonden in vier afzonderlijke clades, gemarkeerd door paarse tinten op het blauwe deel van de verticale balken. Twee PBX-Red sequenties, gemarkeerd door het paarse vierkant, worden uitzonderlijk gevonden in de KNOX-Red1 clade, omdat ze afwijkende aminozuren hebben op sterk geconserveerde posities op Trp19, His23, en Lys31 in hun homeodomain, wat suggereert dat ze ten onrechte geassocieerd zijn met KNOX-Red1. De kleuren van de sequentienamen geven hun fylogenetische groep aan: Blauw voor Glaucophyta, paars voor Rhodophyta, groen voor prasinophytes, lichtblauw voor de chlorophytes, oranje voor Streptophyta, en zwart voor outgroups. De liniaal geeft de genetische afstand aan. Details van de sequenties die door deze fylogenie zijn geanalyseerd, zijn te vinden in Additional file 1: Table S2. *Gloeochaete_wittrockiana_014496 wordt beschouwd als een sequentie van een bannelid-type amoebe die de oorspronkelijke cultuur (SAG46.84) voor het MMETSP1089 transcriptoom contamineerde. **Associatie van KNOX-Red2 klasse sequenties met Amorphea PBC sequenties wordt toegeschreven aan een gedeeld WFGN motief dat DNA-bindende specificiteit van het homeodomain bepaalt via convergente evolutie

KNOX groep sequenties delen dezelfde heterodimerisatie domeinen doorheen Archaeplastida

De volgende vraag was of de plantaardige KNOX klasse ontstaan is vóór het Viridiplantae fylum. De plantaardige KNOX proteïnen en de Chlorophyta GSM1 bezitten de KNOX-homologie, bestaande uit KN-A, KN-B, en ELK domeinen, die vereist is voor hun heterodimerisatie met andere TALE proteïnen ; daarom zou de aanwezigheid van de KNOX-homologie wijzen op het potentieel voor heterodimerisatie tot de KNOX groep. Om homologie domeinen te verzamelen zonder voorafgaande informatie, hebben we ad-hoc homologie domeinen gezocht in de sequenties van de KNOX groep. Met behulp van de geïdentificeerde homologie domeinen als ankers, hebben wij zorgvuldig een uitlijning gemaakt van de KNOX-groep sequenties in combinatie met alle andere TALE sequenties met een KNOX-homologie, (Additional file 3: Figuur S2). Uit deze KNOX alignment vonden we alle KNOX-groep sequenties (met uitzondering van partiële sequenties) die aminozuur similariteitscores > 50% vertoonden voor tenminste twee van de drie domeinen die de KNOX-homologie regio omvatten (Additional file 1: Tabel S3 voor berekende domein homologie). Om te testen of de waargenomen overeenkomst specifiek is voor de TALE sequenties, genereerden we HMM motieven voor KN-A en KN-B domeinen uit de KNOX alignment, zochten deze op in de doelgenen, en bevestigden dat KN-A en KN-B domeinen alleen worden gevonden in de TALE sequenties (Additional file 4: Data S1 en S2). We definieerden aldus KNOX-homologs als de TALE sequenties die doorzoekbare KNOX homologie bezitten (Fig 2, gemarkeerd door rode stippen na hun IDs), wat suggereert dat het KNOX-homolog reeds bestond vóór de evolutie van eukaryote fotosynthese zoals vertegenwoordigd door de Archaeplastida.

Naast de KNOX-homologie bracht dezelfde zoekactie ook twee nieuwe domeinen aan het licht in de C-terminus van het homeodomain (Additional file 3: Figuur S2): het eerste (KN-C1) werd gedeeld door de Chlorophyta sequenties, en het tweede (KN-C2) werd gedeeld door een groep van KNOX homologen in een clade buiten de KNOX-groep (KNOX-Red2).

KNOX klassen divergeerden onafhankelijk tussen de algen phyla

In Viridiplantae, vonden we een enkel KNOX homoloog in de meeste Chlorophyta soorten, terwijl KNOX1 en KNOX2 divergentie duidelijk was in de Streptophyta divisie, inclusief de charophyt Klebsormidium flaccidum en landplanten (Fig. 2). Het nieuw ontdekte KN-C1 domein was specifiek voor de Chlorophyta KNOX sequenties en werd gevonden in alle soorten op één na (Pyramimonas amylifera). De afwezigheid van overeenkomst tussen KN-C1 en de C-terminale extensies van KNOX1/KNOX2 sequenties suggereert onafhankelijke, lineage-specifieke KNOX evolutie in de Chlorophyta en Streptophyta (Additional file 3: Figuur S2). Daarom verwijzen wij naar de Chlorophyta KNOX klassen als KNOX-Chloro in tegenstelling tot de KNOX1 en KNOX2 klassen in de Streptophyta.

De KNOX homologen in de Rhodophyta werden verdeeld in twee klassen: een parafyletische groep dicht bij de KNOX-Chloro clade, KNOX-Red1 genaamd, en een tweede groep dicht bij de PBX-Outgroep, KNOX-Red2 genaamd. KNOX-Red1 miste een KN-A, terwijl KNOX-Red2 een ELK miste en een KN-C2 domein deelde (Additional file 3: Figuur S2). Wij beschouwen KNOX-Red1 als het voorouderlijke type, aangezien de KNOX-Red1 sequenties in alle onderzochte Rhodophyta taxa werden aangetroffen, terwijl de KNOX-Red2 sequenties beperkt waren tot twee taxonomische klassen (Cyanidiophyceae en Florideophyceae). Interessant is dat de KNOX-Red2 clade twee groene algen sequenties omvatte, met sterke statistische ondersteuning (89/89/0.97; Fig. 2); deze bezaten een KN-C2 domein, wat hun afkomst binnen de KNOX-Red2 klasse suggereert (Additional file 3: figuur S2; zie Additional file 2: noot S2 voor verdere discussie over hun mogelijke oorsprong via horizontale genoverdracht).

Beschikbare TALE sequenties waren beperkt voor de Glaucophyta. Wij vonden een enkele KNOX homoloog in twee soorten, die KN-A en KN-B domeinen bezaten maar een ELK domein misten. Wij noemden deze KNOX-Glauco.

Niet-KNOX groep TALEs bezitten dierlijke type PBC-homologie domein, wat suggereert een gedeelde voorouder tussen Archaeplastida en Metazoa

Na de identificatie van KNOX homologs, werden de overblijvende TALE sequenties samengevoegd als de niet-KNOX groep die KN-A en KN-B domeinen mist in Archaeplastida. Verdere classificatie van de niet-KNOX groep was een uitdaging vanwege de sterk divergerende homeodomain sequenties. We stelden echter vast dat het aantal non-KNOX genen per soort grotendeels onveranderlijk was: één in de meeste Rhodophyta en Glaucophyta genomen en twee in de meeste Chlorophyta genomen, wat suggereert dat ze binnen elke radiatie behouden blijven.

Onze ad-hoc homologie-zoekopdracht leverde kritische informatie op voor de non-KNOX classificatie, waarbij een homologiedomein werd geïdentificeerd dat werd gedeeld door alle Glaucophyta en Rhodophyta non-KNOX sequenties (Fig. 3a, b). Aangezien dit domein gelijkenis vertoonde met de tweede helft van het dierlijke PBC-B domein (Pfam ID: PF03792), bekend als heterodimerisatie domein, hebben we dit domein PBL (PBC-B Like) genoemd. Bijgevolg hebben we alle niet-KNOX TALEs in Glaucophyta en Rhodophyta geclassificeerd als een enkele PBC-gerelateerde homeobox klasse, PBX-Glauco of PBX-Red. PBX-Glauco sequenties bezaten ook het MEINOX motief, geconserveerd in het dierlijke PBC-B domein, wat wijst op gemeenschappelijke voorouders van PBC-B en PBL domeinen (Fig. 3a).

Archaeplastida niet-KNOX groep TALEs bezitten een PBC-achtig domein (PBL) bestaande uit N-terminale MEINOX homologie en C-terminale PBC-B homologie. Aminozuur letters in zwart met grijze tinten, in wit met lichte tinten, en in wit met zwarte tinten tonen meer dan 60%, 80%, of 100% overeenkomst in elke kolom. Inverse rode driehoeken geven de weggegooide sequenties in niet-uitgelijnde inserties aan. een PBL-Glauco domein uitlijning, inclusief twee Glaucophyta sequenties die homologie delen in zowel MEINOX homologie en C-terminale helft van het PBC-B domein met niet-Archaeplastida TALE sequenties. Het rode kader geeft het ELK domein aan. b PBL-Red domein uitlijning. Alle Rhodophyta niet-KNOX sequenties bezitten een PBL domein met slechte MEINOX homologie. c PBL-Chloro domein uitlijning. Cyanophora_paradox_20927.63 is ter vergelijking opgenomen. Picocystis_salinarum_02499 is een stichtend lid van de GLX klasse met een PBL-Chloro domein. d Vergelijking tussen PBL domeinen. De bovenste rij toont de consensus gemaakt van de uitlijning van (a), (b), en (c) gecombineerd en de lagere consensus sequenties zijn verzameld van de individuele uitlijningen gepresenteerd in (a), (b) en (c)

GSP1 deelt verre PBC-homologie samen met andere niet-KNOX groep sequenties in Viridiplantae

Een overblijvende vraag was de evolutie van de Chlorophyta niet-KNOX sequenties die blijkbaar geen PBC-homologie hadden. Om zelfs maar een verre homologie te ontdekken, vergeleken we de nieuw gedefinieerde PBL domeinen met de Chlorophyta sequenties door BLAST (cut-off E-waarde van 1E-1) en meervoudige sequentie alignementen. Deze query verzamelde drie prasinophyte en één charophyte TALE sequentie die een MEINOX motief en een vermoedelijk PBL-domein bezaten; zij vertoonden echter onderling een zeer lage sequentie-identiteit (Fig. 3c). Verdere query’s gebruik makend van deze vier sequenties identificeerden 11 extra niet-KNOX sequenties. Negen hiervan werden in twee alignments ondergebracht, één met GSP1 homologs en de andere met de meeste prasinophyte sequenties (Additional file 3: Figuur S3). De twee overblijvende sequenties (Picocystis_salinarum_04995 en Klebsormidium_flaccidum_00021_0250) vertoonden een homologie met een PBX-Red sequentie van Chondrus cruentum (ID:41034) in een ~ 200 aa-lange extensie voorbij het PBL domein, wat hun PBX-Red afstamming suggereert (een ander potentieel geval van horizontale transfers; Additional file 3: Figuur S4). Alle Chlorophyta niet-KNOX sequenties die de PBL-homologie domeinen dragen werden geclassificeerd als GLX (GSP1-like homeobox) in herkenning van het GSP1 eiwit van Chlamydomonas als het eerste gekarakteriseerde lid van deze klasse.

Is de planten BELL klasse homoloog met de Chlorophyta GLX klasse?

De BELL klasse is de enige niet-KNOX klasse bij landplanten, die een POX (Pre-homeobox) domein (PF07526) deelt en een identificeerbaar PBL domein ontbeert. Het genoom van K. flaccidum, één van de twee beschikbare genomen van de charofyt waaruit landplanten zijn ontstaan, bevatte drie niet-KNOX-sequenties, die alle een PBL-domein bezaten (Fig. 3, Additional file 3: Figures S3, S4). Het tweede charofytengenoom van Chara braunii bevatte één vermoedelijke BELL-homoloog die lijkt te zijn afgekapt voor de N-terminale sequenties buiten zijn C-terminale homeodomain, mogelijk als gevolg van het onvolledige genmodel. Daarom lijkt het ontbreken van PBL-homologie in de plantaardige BELL klasse het gevolg te zijn van divergentie of verlies van domeinen van een oude charofytenklasse die wel PBL-homologie had. We vonden een intron op de 24(2/3) homeodomain positie van een K. flaccidum GLX homoloog, die eerder werd geïdentificeerd als specifiek voor de plant BELL klasse (Additional file 3: Figuur S5) , wat suggereert dat de plant BELL klasse is geëvolueerd uit een voorouderlijk GLX gen. Meer taxon steekproeven in charofyten zijn nodig om deze gevolgtrekking te bevestigen.

Twee niet-KNOX paralogen van Chlorophyta heterodimeren met de KNOX homologen

Zelfs met onze gevoelige iteratieve homologie search, konden we geen PBC/PBL-homologie identificeren in ongeveer de helft van de Chlorophyta niet-KNOX sequenties. Aangezien de meeste Chlorophyta genomen één GLX homoloog en één niet-KNOX sequentie zonder PBL-homologie domein bezitten, verwijzen we deze laatste collectief naar Klasse-B (Additional file 3: Figuur S6). Uitzonderingen werden gevonden in één prasinofyten-clade (klasse Mamiellophyceae), waarvan de zes genomen van hoge kwaliteit alle twee niet-KNOX-sequenties zonder PBL-homologie bevatten. Niettemin vormden deze niet-KNOX sequenties twee groepen, de ene meer geconserveerd en de andere minder geconserveerd en polyfyletisch, respectievelijk aangeduid als de Mam-A en Mam-B klassen (Additional file 3: Figures S7, S8). Gezien de reductieve genoomevolutie van de Mamiellophyceae , kan de geconserveerde Mam-A klasse afgeleid zijn van een voorouderlijke GLX klasse.

Twee divergerende niet-KNOX klassen in Chlorophyta leidden tot een kritische vraag over hun dyadische netwerken. Eerdere studies hadden aangetoond dat TALE heterodimeren interactie vereisten tussen MEIS en PBC domeinen in dieren en tussen KNOX en PBL domeinen in Chlamydomonas . Daarom werd voorspeld dat alle Glaucophyta en Rhodophyta TALEs heterodimeren vormen via hun KNOX- en PBL-homologie domeinen. Anderzijds moest nog worden getest of de Chlorophyta TALEs die een PBL-domein missen heterodimeren kunnen vormen met andere TALEs.

Om het interactienetwerk van TALE klasse eiwitten in Chlorophyta te karakteriseren, selecteerden we drie prasinophyte soorten voor eiwit-eiwit interactie assays: twee soorten die Mam-A en Mam-B genen bevatten (Micromonas commoda en Ostreococcus tauri), en een andere soort (Picocystis salinarum), waarvan het transcriptoom één GLX en één Klasse-B sequentie bevatte. In alle drie de soorten vonden we dat KNOX homologs interageerden met alle onderzochte niet-KNOX eiwitten in Mam-A, Mam-B, Klasse-B, en GLX klasse (Fig. 4a-c). Geen enkele interactie werd waargenomen tussen de twee niet-KNOX eiwitten in één van de drie soorten (Fig. 4a-c). Gelijkaardig aan de GLX-KNOX heterodimerisatie, hadden Mam-A en Mam-B ook bijkomende domeinen buiten het homeodomain nodig voor hun heterodimerisatie met de KNOX homologs (Additional file 3: Figuur S9). Deze resultaten toonden aan dat alle divergente niet-KNOX TALEs hun originele activiteit om heterodimeren te vormen met de KNOX homologs behielden. Het waargenomen interagerende netwerk tussen de TALE sequenties is samengevat in Additional file 3: Figuur S10.

TALE TFs nemen deel aan heterodimerisatie netwerken tussen KNOX en niet-KNOX groepen. De aasconstructen geconjugeerd aan het GAL4 DNA-binddomein (DBD) en de prooiconstructen geconjugeerd aan het GAL4 transcriptionele activeringsdomein (AD) worden in de tabel vermeld. Construct combinaties, genummerd 1-8, zijn gerangschikt in wiggen klok-wise, te beginnen bij 9 uur zoals gelabeld in de -LT panelen. Bevestigd op elkaar inwerkende paren worden weergegeven in vette gezichten in de tabel. Het laminine en T-antigen (T-Ag) paar, waarvan bekend is dat het een interacterende partner is, werd als positieve controle in de 8e sector uitgezet. a Assays met M. commoda TALEs. b Assays met O. tauri TALEs. c Assays met P. salinarum TALEs. KNOX-tr verwijst naar het N-terminale afgeknotte KNOX-construct om zelfactivering te voorkomen. d Gedetailleerde construct informatie wordt gegeven in Additional file 1: Table S5

TALE heterodimerization evolved early in eukaryotic history

Onze ontdekking van de PBC-homologie in Archaeplastida suggereert gemeenschappelijke voorouders van de heterodimerizing TALES tussen Metazoa en Archaeplastida. Het voorspelde ook dat andere eukaryote lineages TALEs met de PBC-homologie zouden kunnen bezitten. Buiten dieren, bevat de Pfam database slechts twee PBC-B domein-harboring sequenties, een van een Cryptophyta soort (Guillardia theta, ID:137502) en de andere van een Amoebozoa soort (Acanthamoeba castillian, ID:XP_004342337) . Wij onderzochten verder de Excavata groep, dicht bij de vermeende wortel van de eukaryotische fylogenie. Een zoektocht van twee genomen (Naegleria gruberi en Bodo saltans) verzamelde 12 TALE homeobox sequenties in N.gruberi, en geen in B.saltans, waarvan we er een vonden met een PBC-homologie domein (ID:78561, Fig. 3a) en een met een MEIS/KNOX-homologie (ID:79931, Additional file 3: Figure S2). We doorzochten aanvullende genomen in de Amorphea en vonden de PBC-homologie en MEIS/KNOX-homologie in de TALE sequenties verzameld van Apusozoa, Ichtyhosporea, en Choanoflagellata maar niet van Fungi (Additional file 3: Figuren S11-S14). Onze gegevens suggereren dat de heterodimerisatie domeinen-de PBC-homologie en MEIS/KNOX-homologie- vroeg in de eukaryotische evolutie ontstonden en bleven voortbestaan gedurende de grote eukaryotische radiaties.

Intron-retentie ondersteunt de parallelle evolutie van de heterodimere TALE klassen gedurende eukaryotische radiaties

De alomtegenwoordige aanwezigheid van dyadische TALEs riep de volgende vraag op: Zijn alle dyadische TALEs die in deze studie zijn gerapporteerd de afstammelingen van een enkele voorouderlijke dyad, of zijn zij het resultaat van lineage-specifieke evolutie van een enkele prototypische TALE (proto-TALE) die niet betrokken is bij heterodimerisatie. Om diepe voorouders te peilen, onderzochten wij intron-retentie, dit wordt beschouwd als een lang bewaard gebleven karakter en minder vatbaar voor homoplasie (een karakter vertoond door een set van soorten maar niet aanwezig in hun gemeenschappelijke voorouder) . Vijf intron posities werden gedeeld door ten minste twee TALE klassen, waarvan de 44/45 en 48(2/3) introns gekwalificeerd als de meest voorouderlijke omdat ze werden gevonden in de Archaeplastida en Metazoa (Additional file 3: figuur S5).

De 44/45 en 48(2/3) introns vertoonden een intrigerende exclusieve verdeling tussen de twee dyadische partners van elk fylum: de ene bezit de 44/45 en de andere bezit het 48(2/3) intron (Additional file 3: Figuur S5). Dit wederzijds uitsluitende patroon suggereert dat er twee TALE genen met verschillende intron posities bestonden aan het begin van de eukaryotische radiatie. Wij beschouwen de 44/45 intron positie als de meest voorouderlijke, gezien het feit dat het geconserveerd was in de meeste niet-TALE homeobox genen. In dit verband speculeren wij dat de verwerving van de 48(2/3), en het verlies van het 44/45 intron, gepaard ging met een vroege gebeurtenis waarbij de proto-TALE met het 44/45 intron werd gedupliceerd om een tweede TALE met het 48(2/3) intron te genereren. Aangezien de 48(2/3) intron positie werd gevonden in de KNOX/MEIS groep genen in Viridiplantae en Metazoa en ook in de PBX groep genen in Rhodophyta en Cryptophyta, kunnen we speculeren dat de gedupliceerde TALEs vroeg ontstonden en diversifieerden om lineage-specifieke heterodimeric configuraties te vestigen gedurende eukaryotische radiaties. Een andere mogelijkheid is dat de 48(2/3) intron positie in het TALE homeodomain vele malen is verworven tijdens eukaryotische radiaties.

Gezien het feit dat de heterodimere TALEs evolueerden op een lineage-specifieke wijze, vroegen wij ons af hoe de proto-TALE eruit zag op het moment dat deze een duplicatie onderging. De volgende waarnemingen suggereren dat de proto-TALE een homodimeriserend eiwit was. Ten eerste, de PBC-homologie domeinen van PBX/GLX klasse eiwitten geïdentificeerd in de Archaeplastida bevatten het MEINOX-motief dat oorspronkelijk gedefinieerd werd voor zijn gelijkenis met de MEIS/KNOX-homologie domeinen (Fig. 3) . Ten tweede, PBX-Glauco sequenties bezitten de ELK-homologie binnen hun PBL domein (Fig. 3), die goed uitlijnen met de ELK domeinen van KNOX klasse sequenties in Viridiplantae (Additional file 3: Figuur S15). Daarom ondersteunen het MEINOX-motief en de ELK-homologie in de heterodimeriserende KNOX en PBX groepen de gemeenschappelijke oorsprong van heterodimeriserende TALE groepen uit een enkele TALE door duplicatie gevolgd door subfunctionalisatie.