Differentiatie tussen everzwijn en als huisdier gehouden varken in voedsel door targeting twee gen loci door real-time PCR

Primer en probe design

Voor primer en probe design, selecteerden we polymorfismen die reeds gerapporteerd waren om de discriminatie van everzwijn en als huisdier gehouden varken mogelijk te maken. We begonnen met de SNP g.299084751 C > T in het NR6A1 gen, waarvan is gevonden dat het geassocieerd is met het aantal borst- en lendenwervels: wilde zwijnen, die homozygoot zijn voor het wildtype allel g.299084751 C, hebben 19 wervels, terwijl tamme varkens, die homozygoot zijn voor g.299084751 T, 21-23 wervels hebben. In de studie van Fontanesi et al. werd deze SNP gebruikt om everzwijnen en tamme varkens te discrimineren door PCR-RFLP10. Wij hebben één primerpaar ontworpen voor amplificatie van de doelregio in zowel everzwijn als tamme varken, en twee TaqMan probes, specifiek voor respectievelijk het everzwijn-allel (g.299084751 C) en het tamme varken-allel (g.299084751 T). De duplex assay zou het mogelijk moeten maken om wilde zwijnen en tamme varkens tegelijkertijd in één en hetzelfde putje te detecteren. In totaal hebben wij vier forward primers, drie reverse primers, vier wild zwijn probes en één tamme varken probe ontworpen en deze gecombineerd tot 21 primer/probe systemen (Chr1a – u, supplementaire tabel 1). Primer/probe systeem Chr1a richt zich op de bovenstreng, primer/probe systemen Chr1b-u op de onderstreng van het NR6A1 gen. In een reeks experimenten onderzochten we of de primer/probe systemen specifiek waren voor wilde zwijnen of kruisreactiviteit vertoonden met tamme varkensrassen/-kruisingen. Primer/probe systeem Chr1a resulteerde in een ΔCt waarde ≥ 10.56 tussen tamme varkens en everzwijnen (supplementaire tabel 2). Voor primer/probe systemen Chr1i – o varieerden de ΔCt waarden van 8,65 tot 11,19. Primer/probe-systemen Chr1b – h en Chr1p – t resulteerden niet in een toename van het fluorescentiesignaal voor tamme varkensrassen/-kruisingen. Aangezien primer/probe systeem Chr1q resulteerde in de laagste Ct waarde (24.77; n = 2) voor wilde zwijnen, hebben we de toepasbaarheid ervan getest in combinatie met een TaqMan probe voor gedomesticeerd varken in het duplex assay formaat (primer/probe systeem Chr1u, supplementaire tabel 1). Aangezien de Ct-waarden voor zowel everzwijn (26,21, n = 2) als als huisdier gehouden varken (27,90, n = 2) bevredigend waren, werden alle verdere PCR-experimenten gericht op SNP g.299084751 C > T uitgevoerd met primer/probe-systeem Chr1u. In het navolgende wordt de duplex real-time PCR-assay assayChr1 genoemd, bestaande uit de assay voor tamme varkens, assayChr1D, met forward primer Chr1f4, reverse primer Chr1r2 en probe Chr1p1D, en de assay voor wilde zwijnen, assayChr1W, met forward primer Chr1f4, reverse primer Chr1r2 en probe Chr1p4W (Fig. 1A).

Partiële sequenties van (A) het NR6A1-gen op chromosoom 1 met SNP g.299084751 C > T, waarop de duplextest “assayChr1” is gericht, en (B) chromosoom 9 met het SNP g.118314929 A > G (rs81416363), waarop de twee singleplex-tests “assayChr9D” en “assayChr9W” zijn gericht. Pijlen geven de posities van de primers (donkergrijs) en probes (lichtgrijs) aan. (A) Duplex assayChr1 bevatte forward primer Chr1f4, reverse primer Chr1r2, probe Chr1p4W en probe Chr1p1D. (B) Singleplex assayChr9D bevatte forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D en probe Chr9p2; singleplex assayChr9W bevatte forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W en probe Chr9p2. Subsoort-specifieke basen worden vetgedrukt weergegeven (verticale rode pijlen) en mismatch basen in blauw (verticale blauwe pijlen).

Omdat wij uit de literatuur hadden vernomen dat het onderscheidend vermogen door ons slechts op één polymorfisme te richten hoogstwaarschijnlijk niet voldoende is, zochten wij naar een andere geschikte gen locus. Door 20 SNPs te onderzoeken op hun toepasbaarheid om wilde zwijnen van tamme varkens te onderscheiden, hadden Beugin et al. de SNPs rs80864596 (intergenic, chromosoom 5), rs80796712 (glycogeensynthase kinase 3-beta, chromosoom 13) en rs81416363 (intergenic, chromosoom 9) gevonden die het hoogste onderscheidingsvermogen vertoonden11. Daarom kozen wij deze drie SNP’s voor het ontwerpen van primer/probe-systemen. In vergelijking met het primer/probe-ontwerp voor SNP g.299084751 C > T, volgden wij een andere strategie. In plaats van de ondersoort-specifieke base in de probe te plaatsen, plaatsten we die op de voorlaatste plaats van het 5′-uiteinde van de voorwaartse of de achterwaartse primer. Om de specificiteit te verhogen, introduceerden we opzettelijke base-mismatches. Deze zogeheten mismatch amplification mutation assay (MAMA)-techniek12,13 heeft het voordeel dat zij vrij kosteneffectief is omdat één en dezelfde probe met een aantal primers kan worden getest die op verschillende plaatsen een mismatch hebben. In de eerste reeks experimenten hebben we de mismatch base ingebracht op de 3e of de 6e positie vanaf het 3′-uiteinde van de primer met de subspeciespecifieke base. Bij de ontwikkeling van real-time PCR-tests voor respectievelijk edelhert, damhert en sikahert14,15,16 bleek deze strategie succesvol te zijn. In de huidige studie kon echter met geen van de primer/probe-systemen (Chr5b – d, Chr13b – c, Chr9b – g, Chr9i – n, aanvullende tabel 1) een onderscheid worden gemaakt tussen tamme varkens en wilde zwijnen (aanvullende tabel 3). De beste resultaten (ΔCt-waarde tussen tamme varkensrassen/kruisingen en everzwijnen ≥5,24) werden verkregen met primer/probe-systeem Chr9j. In dit primer/probe-systeem, gericht op het SNP rs81416363 op chromosoom 9, bevond de mismatch base zich op de derde positie vanaf het 3′-uiteinde van de primer (TTCACG → TTCCCG). Om de specificiteit te verhogen, introduceerden we een verdere mismatch in de 4e (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) of 5e positie (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) vanaf het 3′ einde van de primer. De invoering van extra mismatches bleek succesvol te zijn. Met primer/probe systeem Chr9r (Supplementary Table 1) verkregen we zowel de laagste Ct waarde voor wilde zwijnen (22.09; n = 2) als de hoogste ΔCt waarde (10.52) tussen tamme varkensrassen/kruisingen en wilde zwijnen (Supplementary Table 3). Deze real-time PCR-test voor everzwijnen, gericht op de SNP rs81416363 op chromosoom 9, was gebaseerd op primer/probe-systeem Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Volgende, pasten we de MAMA-strategie toe om de overeenkomstige real-time PCR-test, gericht op de SNP rs81416363 op chromosoom 9, voor tamme varkens te ontwikkelen. We plaatsten de varkensspecifieke base op de voorlaatste base van het 5′-uiteinde van de primer en de mismatch base op de 3e positie van het 3′-uiteinde (primer/probe systemen Chr9v – x; supplementaire tabel 1). De invoering van één mismatch base was echter niet voldoende om de differentiatie tussen tamme varkens en wilde zwijnen mogelijk te maken. De invoering van mismatchbasen op de 3de en 5de positie vanaf het 3′-uiteinde van de primer (primer/probe systemen Chr9y – ag) leidde tot een ΔCt-waarde ≥ 4,83. Wanneer de mismatches op positie 3 en 4 zaten (primer/probe systems Chr9ah – aj), was de ΔCt-waarde ≥ 5,85. Door drie opeenvolgende mismatchbasen naast de subsoort-specifieke base te introduceren (primer/probe systemen Chr9ak – am), kon de specificiteit worden verhoogd. Primer/probe-systeem Chr9ak, waarin de mismatches zich op positie 3, 4 en 5 bevonden (TTCATG → TGGTTG) leidde tot de hoogste ΔCt-waarde van ≥9,97. Daarom werden alle verdere experimenten uitgevoerd met primer/probe-systeem Chr9ak. In het volgende worden de twee singleplex-tests gericht op de SNP rs81416363 op chromosoom 9 aangeduid als assayChr9D, met forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D en probe Chr9p2, en assayChr9W, met forward primer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W en probe Chr9p2 (fig. 1B).

Optimalisatie van primer/probe concentratie en ratio

Alle hierboven gepresenteerde resultaten werden verkregen met primer en probe concentraties van 500 nM en 200 nM (primer/probe systemen gericht op chromosoom 1), en 200 nM en 100 nM (primer/probe systemen gericht op chromosomen 5, 9 en 13), respectievelijk. Vervolgens hebben wij onderzocht of de specificiteit van de real-time PCR-tests kon worden verhoogd door optimalisering van de primer/probe-concentratie en -verhouding. In het geval van assayChr1 bleken de optimale primer- en probeconcentraties respectievelijk 1.000 nM en 200 nM te zijn (aanvullende tabel 4). In het geval van assayChr9W en assayChr9D resulteerde een overschot van de primer met zowel de subsoort-specifieke base als de mismatch-basen in hogere ΔCt-waarden tussen de kruisreagerende subsoort en de doelsoort. De hoogste selectiviteit van assayChr9W en assayChr9D werd bereikt met voorwaartse primer/achterwaartse primer/probe-concentraties van respectievelijk 12,5/200/50 nM en 62,5/800/50 nM.

Kruisreactiviteitstests

Verder voerden we kruisreactiviteitstests uit met DNA-isolaten van wilde zwijnen, diverse gedomesticeerde varkensrassen/kruisrassen en nog eens 22 diersoorten die in de aanvullende tabel 5 worden vermeld. Figuur 2A-D tonen de amplificatiecurves verkregen met assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W en assayChr1D, respectievelijk. AssayChr9W vertoonde een lichte kruisreactiviteit met als huisdier gehouden varkens, sikaherten, alpiene steenbokken, schapen, geiten en gemzen (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D met wilde zwijnen, sikaherten, elanden, paarden en kalkoenen (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). In tegenstelling tot de assays gericht op de SNP rs81416363 op chromosoom 9, vertoonde assayChr1 geen kruisreactiviteit (met uitzondering van assayChr1W voor reeën in slechts één van de vier replicaten). We hebben ook DNA-isolaten geanalyseerd van 50 plantensoorten die gewoonlijk als voedselingrediënt worden gebruikt (aanvullende tabel 6). Geen van de assays vertoonde kruisreactiviteit met een van de plantensoorten.

Resultaten verkregen door het uitvoeren van kruisreactiviteitstests met DNA-isolaten (10 ng/µL) van 22 diersoorten en wilde zwijnen/ tamme varkens. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W en (D) assayChr1D.

Screening van verschillende commerciële mastermixen op hun toepasbaarheid

In een volgende reeks experimenten onderzochten we of het type van de commerciële mastermix de selectiviteit van de assays beïnvloedde. Wij analyseerden DNA-isolaten van 23 diersoorten, waaronder 3 everzwijn-individuen en 11 rassen/kruisingen van tamme varkens met in totaal vijf mastermixen van verschillende leveranciers. De mastermixen en de respectieve temperatuurprogramma’s worden vermeld in aanvullende tabel 7. In het algemeen beïnvloedde het type mastermix zowel de absolute Ct-waarden als de ΔCt-waarden tussen doelsoort en kruisreagerende (sub)soorten. De real-time PCR-assays werden echter in verschillende mate beïnvloed. In het geval van assayChr9W, bijvoorbeeld, resulteerden mix 2 en 3 in hogere Ct-waarden dan mastermix 1 (de standaard mastermix in de huidige studie), 4 en 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). In het geval van assayChr9D was het type mastermix van invloed op de ΔCt-waarden en daarmee op de selectiviteit van de assay. ΔCt-waarden verkregen met mastermix 1, 2, 3 en 4 waren respectievelijk ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 en ≥ 5,86, terwijl met mastermix 5 in het geheel geen kruisreactiviteit werd waargenomen. In het geval van assayChr1 werden tamelijk vergelijkbare Ct-waarden verkregen met mastermix 1, 3 en 4. Mastermix 2 en 5 resulteerden echter niet in de vorming van producten, hoogstwaarschijnlijk omdat deze mixen niet geschikt zijn voor multiplexing. Op grond van deze bevindingen wordt ten zeerste aanbevolen de toepasbaarheid te testen als het de bedoeling is een ander type mastermix te gebruiken.

Robuustheid

De robuustheid van de real-time PCR-assays werd onderzocht door de annealingtemperatuur ±1 °C en het volume van de reactiemix per well met ±5% te variëren en door twee verschillende real-time PCR-cyclers toe te passen. De experimenten werden uitgevoerd met DNA-isolaten van wilde zwijnen, tamme varkens en reeën. Voor assayChr9W en assayChr9D waren de Ct-waarden zeer vergelijkbaar met die verkregen onder standaardomstandigheden (ΔCt-waarden <1,00), behalve wanneer de annealingtemperatuur tot 61 °C werd verhoogd (ΔCt-waarden ≤2,16 en ≤1,57, respectievelijk). Met ΔCt-waarden ≤0,77 bleek assayChr1 nog robuuster te zijn. Noch het verlagen van het totale reactievolume, noch het gebruik van een andere real-time PCR cycler beïnvloedde de Ct waarden substantieel, wat de robuustheid van de real-time PCR assays aantoont.

Werkbereik, lineair bereik en amplificatie-efficiëntie

Door analyse van een DNA-isolaat van wilde zwijnen (211 µg/mL) en twee DNA-isolaten van tamme varkens (158 µg/mL en 160 µg/mL) in seriële verdunning in water (1:2-1:524,288), waren assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W en assayChr1D lineair tussen 211 µg/mL en 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL en 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL en 6 ng/mL (R2 = 0,9994) en 160 µg/mL en 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectievelijk (Fig. 3A). De amplificatie-efficiënties berekend uit de hellingen van de standaardcurven bedroegen respectievelijk 83%, 96%, 93% en 95%. Bovendien werd het lineariteitsbereik geëvalueerd door DNA-isolaten van wilde zwijnen en tamme varkens serieel verdund in DNA van haringensperma te analyseren. Voor assayChr9W en assayChr9D varieerde de lineariteit van respectievelijk 20 µg/mL tot 20 ng/mL (R2 = 0,9988) en 20 µg/mL tot 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (Fig. 3B). In het geval van assayChr1W en assayChr1D was de lineariteit in het bereik van 20 µg/mL tot 5 ng/mL (R2 = 0,9978) en 20 µg/mL tot 10 ng/mL (R2 = 0,9988), respectievelijk. De amplificatie-efficiënties berekend uit de hellingen van de standaardcurven bedroegen respectievelijk 76%, 90%, 97% en 101%.

Bereik van lineariteit van de vier assays, (A) bepaald in water als achtergrond en (B) bepaald in DNA van haringensperma als niet-doelgroep achtergrond-DNA.

Uit deze resultaten blijkt dat het werkbereik van de real-time PCR-tests vrijwel identiek is, terwijl het lineariteitsbereik kleiner is voor de tests die op chromosoom 9 zijn gericht dan voor die welke op chromosoom 1 zijn gericht. Alle amplificatie-efficiënties lagen tussen 90% en 110%, zoals aanbevolen in de ENGL-richtsnoeren17 , behalve die van assayChr9W (83% in water, 76% in DNA van haringensperma). De lagere amplificatie-efficiëntie van assayChr9W wordt hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door de verminderde stabiliteit van de primerbinding als gevolg van de mismatches, geïntroduceerd om de selectiviteit voor de doeldiersoort te verhogen.

Limit of detection (LOD) in haringensperma-DNA en varkens-DNA als achtergrond-DNA

De LOD werd gedefinieerd als de laagste DNA-concentratie die resulteerde in een toename van het fluorescentiesignaal in ten minste 19 van de 20 replicaten. Bovendien moet de Ct-waarde lager zijn dan de Ct-waarde die voor kruisreagerende soorten wordt verkregen.

In DNA van haring sperma was de LOD van assayChr9D (1,0%, w/w, Fig. 4A) was iets hoger dan de LOD van de andere drie assays (0,2%, w/w, Fig. 4B-D). De hogere LOD van assayChr9D wordt veroorzaakt door de kruisreactiviteit met everzwijn (ΔCt-waarde tussen everzwijn en tamme varken slechts ≥8,41).

Bepaling van de LOD door analyse van seriële verdunningen van (A-D) DNA-mengsels met DNA van everzwijn of everzwijn in DNA van haringensperma en (E-H) een DNA-mengsel met DNA van everzwijn in DNA van everzwijn of DNA van everzwijn in DNA van everzwijn als achtergrond-DNA. (A,E) werden verkregen door gebruik te maken van assayChr9D, (B,F) door gebruik te maken van assayChr9W, (C,G) door gebruik te maken van assayChr1D en (D,H) door gebruik te maken van assayChr1W. De metingen werden uitgevoerd in 20 herhalingen. Cirkels vertegenwoordigen individuele Ct-waarden, horizontale lijnen geven de gemiddelde waarden aan.

Daarnaast bepaalden we de LOD van de real-time PCR-tests voor wilde zwijnen, assayChr1W en assayChr9W, in DNA van gedomesticeerde varkens als achtergrond, en die van de assays voor gedomesticeerde varkens, assayChr1D en assayChr9D, in DNA van wilde zwijnen als achtergrond. Met 2%, 0,2%, 5% en 2% (m/m) waren de LOD’s van assayChr9D (fig. 4E), assayChr9W (fig. 4F), assayChr1D (fig. 4G) en assayChr1W (fig. 4H) nogal verschillend. De hogere LOD van assayChr1D in aanwezigheid van DNA van everzwijnen werd veroorzaakt door signaalonderdrukking, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van competitie van de twee probes voor de doelsequentie in het duplex assayformaat. Om de signaalonderdrukking nader te onderzoeken werden DNA-mengsels geanalyseerd die 25% (m/m) DNA van everzwijnen in DNA van als huisdier gehouden varkens of 25% (m/m) DNA van als huisdier gehouden varkens in DNA van everzwijnen, naast positieve controles (DNA van everzwijnen en DNA van als huisdier gehouden varkens, respectievelijk).

Toen we de positieve controles vergeleken met de 1:4 verdunde standaarden die niet-doel DNA bevatten, vonden we geen verschil in de amplificatiecurves (ΔRn waarden) voor assayChr9W en assayChr9D (Fig. 5A,B). In het geval van assayChr1W en assayChr1D waren de fluorescentiesignalen (ΔRn-waarden) voor de positieve controle echter hoger dan die voor de 1:4 verdunde standaard bij dezelfde DNA-doelwitconcentratie (fig. 5C,D).

Mplificatiecurven (in semi-logweergave) verkregen voor DNA-mengsels (20 ng/µL) die 25% (m/m) van de beoogde ondersoort (wild zwijn of als huisdier gehouden varken) en 75% (m/m) van de niet-doelsoort (wild zwijn of als huisdier gehouden varken) bevatten, en seriële verdunningen daarvan (1:4 tot 1:1.024). DNA-isolaten (5 ng/µL) van respectievelijk everzwijn en als huisdier gehouden varken werden als controle gebruikt. AssayChr9W (A) en assayChr9D (B) vertonen kruisreactiviteit met de niet-doelondersoort. AssayChr1W (C) en assayChr1D (D) vertonen signaalonderdrukking in aanwezigheid van niet-doelondersoort.

Herhaalbaarheid

De herhaalbaarheid van de real-time PCR-tests werd onderzocht door vleesextractmengsels met 30% (m/m) DNA van de doelsoort en 70% (m/m) DNA van de niet-doelondersoort, alsmede seriële verdunningen daarvan, vijf keer in duplo te analyseren op vier verschillende dagen. De RSD van de Ct-waarden was ≤1.0% (assayChr1W), ≤1.9% (assayChr9W), ≤2.3% (assayChr1D) en ≤3.5% (assayChr9D), wat de hoge herhaalbaarheid van de assays aantoont.

Analyse van monsters van wilde zwijnen en tamme varkens

De real-time PCR-assays werden toegepast op de analyse van monsters van 64 tamme varkens, waaronder 14 rassen en 6 kruisingen (Fig. 6A). Bovendien analyseerden we een totaal van 30 everzwijnmonsters uit 5 verschillende landen (Oostenrijk, Estland, Duitsland, Roemenië en de VS, Fig. 6B). Van één everzwijn individueel uit Europa was de exacte herkomst onbekend. Elk monster werd geanalyseerd in ten minste vier replicaten. Aan elke PCR-plaat werd een positieve controle (DNA-mengsel, 10 ng/µL) toegevoegd, die de beoogde ondersoort bevatte in dezelfde concentratie als de LOD, die de afkapwaarde Ct oplevert.

Resultaten voor (A) 64 monsters van tamme varkens en (B) 30 monsters van wilde zwijnen. De metingen zijn uitgevoerd in ten minste vier replicaten.

Toen we de positieve controles in 14 replicaten analyseerden, was het gemiddelde ± SD van de Ct-waarden 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) en 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). Met uitzondering van assayChr9D werden alle monsters die hogere Ct-waarden opleverden als <LOD beschouwd. In het geval van assayChr9D werden voor verscheidene monsters van everzwijnen Ct-waarden ≥ 34,61 verkregen. Om de kans op vals-positieve resultaten te verlagen, hebben we de cut-off Ct-waarde van assayChr9D op 34,00 gesteld. Voor de toepassing van assayChr9W en assayChr9D in routineanalyses bevelen wij aan een positieve controle te gebruiken bestaande uit 2% (m/m) DNA van tamme varkens, 0,2% (m/m) DNA van wilde zwijnen en 97,8% (m/m) DNA van haring sperma.

Voor de analyse van monsters van tamme varkens met assayChr9D verkregen wij 63 positieve en slechts één negatief resultaat (Mangalica 1) (Fig. 6). Van de 12 Cinta Senese individuen analyseerden wij twee verschillende vleesdelen, een mager monster (van longissimus dorsi) en een onderhuids rugvet monster (van lende) (gegevens niet weergegeven). De Ct-waarden verkregen voor magere monsters (gemiddelde Ct ± SD van 25,24 ± 0,44, n = 48) waren zeer vergelijkbaar met die voor subcutane rugvetmonsters (26,29 ± 0,35, n = 48). Toen we de 30 everzwijnmonsters analyseerden met assayChr9D, resulteerden 21 niet in een toename van het fluorescentiesignaal, maar negen individuen (één uit Oostenrijk, vijf uit Duitsland en drie uit de VS) werden geïdentificeerd als tam varken.

Met assayChr9W werd de meerderheid van de everzwijnmonsters correct toegewezen, slechts voor drie monsters (één uit Duitsland en twee uit de VS) verkregen we negatieve resultaten. AssayChr9W leidde echter ook tot positieve resultaten voor enkele tamme varkens, waaronder één Bentheim Black Pied, drie Krškopolje en drie Mangalica varkens. Met name de drie Mangalica-varkens uit Oostenrijk werden geïdentificeerd als tamme varkens, terwijl de drie individuen uit Duitsland werden geïdentificeerd als wilde zwijnen. In het geval van assayChr9, met inbegrip van assayChr9W en assayChr9D, leidden 12 van de 94 vleesmonsters tot dubbelzinnige resultaten, omdat een toename van het fluorescentiesignaal werd verkregen met beide real-time PCR-assays. Bovendien werd één Mangalica varken individu geïdentificeerd als everzwijn en drie everzwijn individuen als tam varken.

In de studie van Beugin et al.11 was de geschiktheid van de SNP rs81416363 getest op “zuivere” everzwijnen gejaagd in een natuurpark in de Vogezen in Frankrijk en een beperkt aantal commerciële varkensrassen (Landrace, Large White, Piétrain en Duroc). Wilde zwijnen bleken het G allel te dragen (frequentie 100%, geen heterozygositeit), tamme varkens het A allel (frequentie 98%, heterozygositeit 5%).

Om uit te vinden waarom assayChr9W en assayChr9D tot verscheidene misclassificaties en enkele dubbelzinnige resultaten leidden, genotypeerden wij de respectievelijke monsters van wilde zwijnen en tamme varkens door middel van hoge resolutie smeltanalyse (HRM). We pasten HRM analyse toe omdat het een krachtige, tijd- en kostenefficiënte techniek is voor SNP genotypering18. De genormaliseerde smeltcurven (Fig. 7A) geven aan dat het homozygote G-genotype niet alleen werd gevonden voor everzwijnmonsters, maar ook voor het Mangalica-monster (monster 1) waarvoor een toename van het fluorescentiesignaal werd verkregen met assayChr9W maar niet met assayChr9D. Wilde zwijnmonsters die resulteerden in een toename van het fluorescentiesignaal met assayChr9D bleken ten minste één kopie van het A-allel te dragen. Vier everzwijnen vertoonden het heterozygote genotype, vijf waren homozygoot voor het A-allel. Bovendien bleken vijf als huisdier gehouden varkens, waaronder drie dieren uit Krškopolje in Slovenië, drager te zijn van zowel het A- als het G-allel. Met HRM-genotypering konden we dus verifiëren dat de resultaten van assayChr9W en assayChr9D in overeenstemming waren met de respectieve genotypes van de individuen. Onze resultaten tonen echter aan dat de twee singleplex-tests gericht op SNP rs81416363, assayChr9W en assayChr9D, geen ondubbelzinnig onderscheid tussen everzwijn en tam varken mogelijk maken.

Genormaliseerde HRM-curven voor (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) op chromosoom 9 voor homozygoot G (wild zwijn), homozygoot A (tamme varken) en heterozygoot A + G en (B) SNP g.299084751 C > T op chromosoom 1 voor homozygoot C (everzwijn), homozygoot T (tamme big) en heterozygoot C + T.

Met assayChr1D werden alle monsters van tamme varkens, op drie na, geclassificeerd als tamme varkens (fig. 6). In overeenstemming met assayChr9D waren de Ct-waarden verkregen voor magere en onderhuidse rugvetmonsters van de 12 Cinta Senese individuen zeer vergelijkbaar (gemiddelde Ct ± SD van respectievelijk 25,99 ± 0,25 (n = 48) en 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Echter, met assayChr1D werden ook vijf van de 30 everzwijnmonsters geïdentificeerd als tam varken. De analyse van monsters van wilde zwijnen met assayChr1W leidde tot slechts één negatief resultaat. Echter, ook één Mangalica monster en zes Turopolje individuen leidden tot een toename van het fluorescentiesignaal met assayChr1W.

In de studie van Fontanesi et al.10 had de SNP g.299084751 C > T gegenotypeerd door monsters te analyseren van 293 tamme varkens van vijf commerciële rassen (Italiaanse Large White, Italiaanse Landrace, Italiaanse Duroc, Belgische Landrace en Piétrain) en 201 wilde zwijnen uit Zuid-Centraal Europa (Noord-Italië) en Zuidoost-Europa (Slovenië en de westelijke Balkanregio’s). Fontanesi et al. vonden dat alle tamme varkens homozygoot waren voor het T-allel. 7,5% van de everzwijnen droeg minstens één kopie van het T-allel, waarbij individuen uit Zuidoost-Europa vaker (12,2%) dan individuen uit Zuid-Centraal-Europa (3,6%). 11.1% van de everzwijnen uit Zuidoost-Europa hadden het heterozygote C/T genotype.

Toen we de everzwijnen en tamme varkens individuen genotypeerden voor SNP g.299084751 C > T door HRM analyse, ontdekten we het T allel niet alleen bij tamme varkens maar ook bij sommige everzwijnen (Fig. 7B). Het everzwijn individu uit de USA vertoonde het homozygote T genotype, terwijl het everzwijn individu uit Neder-Oostenrijk zowel het C als het T allel droeg. De meerderheid van de everzwijn individuen was echter homozygoot voor het C allel. Dit resultaat geeft aan dat de toename van het fluorescentiesignaal voor drie everzwijnmonsters (Duitsland Bad Kissingen en Perleberg, en Europa) verkregen met assayChr1D niet in overeenstemming was met hun genotype en dus veroorzaakt werd door kruisreactiviteit. De meerderheid van de als huisdier gehouden varkens bleek homozygoot te zijn voor het T-allel. Zes van de acht Turopolje-individuen bleken echter het heterozygote C/T-genotype te vertonen, wat verklaart waarom een toename van het fluorescentiesignaal werd verkregen met zowel assayChr1D als assayChr1W. De hoge frequentie van het heterozygote C/T-genotype in Turopolje, een tam varkensras uit Kroatië, is in overeenstemming met een zeer recent artikel van de onderzoeksgroep van Fontanesi. Door 47 Turopolje individuen te genotyperen, werd de frequentie van het T en het C allel gerapporteerd als respectievelijk 0.57 en 0.43.

Onze resultaten tonen aan dat noch de twee singleplex assays gericht op SNP rs81416363 noch de duplex assay gericht op SNP g.299084751 C > T alleen het ondubbelzinnige onderscheid tussen wilde zwijnen en tamme zwijnen mogelijk maken. Door echter rekening te houden met de resultaten van de twee singleplex-tests en de duplex-test, kan het onderscheidingsvermogen drastisch worden verhoogd. Onze resultaten tonen aan dat indien de twee assays voor dezelfde ondersoort (b.v. assayChr9D en assayChr1D) tot dezelfde classificatie leiden (in het gegeven voorbeeld als huisdier gehouden varken), en de resultaten verkregen met de twee assays voor de andere ondersoort (in het gegeven voorbeeld assayChr9W en assayChr1W) dubbelzinnig zijn, de kans op verkeerde classificatie gering is indien men zich baseert op de resultaten die identiek zijn. Volgens deze strategie konden 86 (91,5%) van de 94 individuen correct worden toegewezen.