Restriction-modification
Restriction-modification (RM) systemen komen alom voor in het prokaryotische rijk, waar zij dienen als afweersysteem tegen vreemd DNA. Momenteel zijn er 47 type I, 3320 type II en acht type III systemen bekend. R. Roberts (Beverly, MA) wees erop dat restrictie-enzymen tot voor kort werden geïdentificeerd door bacteriën uit kweekcollecties en milieumonsters te halen en deze op restrictie-activiteit te analyseren. Nu is het mogelijk om nieuwe DNA-sequenties te screenen op genen voor DNA-methyltransferase (MTase), die kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun geconserveerde motieven, en vervolgens te zoeken naar geassocieerde genen. Dit zijn goede kandidaten voor restrictie-endonuclease-genen, omdat de genen van DNA-methyltransferasen en restrictie-endonucleasen vaak aan elkaar gekoppeld zijn. Recente genoomprojecten hebben op deze manier een onverwacht groot aantal putatieve RM-systemen geïdentificeerd. Zo werden in het genoom van Helicobacter pylori 25 verschillende MTase-genen geïdentificeerd, en sommige daarvan waren geassocieerd met restrictie-enzymgenen. Screening van databanken kan dus een zeer productieve methode worden voor het vinden van restrictie-enzymen met nieuwe specificiteiten. A. Piekarowicz (Warschau, Polen) rapporteerde over een voorbeeld van een dergelijke aanpak die leidde tot de identificatie van een nieuw type IC-restrictie-enzym, NgoAXVI.
Type I- en type III-restrictie-enzymen, evenals het methylafhankelijke McrBC-enzym, vereisen twee herkenningspunten en zijn voor DNA-splitsing afhankelijk van ATP (McrBC: GTP) hydrolyse (besproken in Rao et al., 2000). Splitsing vindt plaats wanneer twee van dergelijke enzymen met elkaar in botsing komen tijdens het transporteren van DNA, hetgeen de eis van twee herkenningspunten verklaart (Figuur (Figuur2).2). T. Bickle (Bazel, Zwitserland) heeft aangetoond dat type I-enzymen en McrBC ook kunnen worden gestimuleerd om DNA te klieven wanneer zij op een niet-specifieke blokkade stuiten. Type III-enzymen daarentegen worden door dergelijke blokkades geremd, omdat elk translocerend enzym slechts één streng doorsnijdt en de medewerking van een ander enzym nodig heeft voor de splitsing van beide DNA-strengen.
Fig. 2. Model voor de activering van restrictie-enzymen die ATP (of GTP) nodig hebben voor DNA-splitsing. Na binding van twee enzymmoleculen (of complexen) aan twee herkenningsplaatsen op een lineair DNA-molecuul wordt het DNA getranslokeerd in een actief, energieafhankelijk proces waarvoor, afhankelijk van het systeem, ATP of GTP nodig is. Daarbij wordt het DNA uitgelust. Splitsing vindt plaats na botsing van twee translocerende complexen, op willekeurige plaatsen in de nabijheid van de herkenningsplaatsen (type III enzymen en McrBC) of verder daarvandaan (type I enzymen).
Hoewel de meeste type II restrictie-enzymen homodimeren zijn die met één kopie van hun palindromische herkenningsplaats interageren, bestaan er subtypes die samenwerking van twee plaatsen vereisen (besproken in Pingoud en Jeltsch, 1997). Zoals S. Halford (Bristol, UK) opmerkte, is dit niet alleen het geval voor enzymen van type IIe, zoals NaeI, maar ook voor enzymen van type IIf, zoals SfiI, en enzymen van type IIS, zoals FokI. Type IIf-enzymen zijn homotetrameren met twee afzonderlijke DNA-bindingsplaatsen, die elk door twee subeenheden worden gevormd. SfiI is alleen actief wanneer beide DNA-bindingsplaatsen bezet zijn, hetgeen leidt tot een gelijktijdige splitsing van beide plaatsen. Voor FokI, dat bestaat uit een splijtings- en een herkenningsdomein, is eerder aangetoond dat dimerisatie van het enzym op het DNA vereist is om splitsing te laten plaatsvinden. Halford heeft nu aangetoond dat twee herkenningsplaatsen vereist zijn voor efficiënte splitsing, omdat elk van de herkenningsdomeinen moet interageren met een herkenningssequentie. Alle drie de typen enzymen werken optimaal met twee plaatsen op hetzelfde DNA, waar zij het DNA tussen de plaatsen in een lus vangen.
Atypische type II restrictie-enzymen worden nog steeds ontdekt. BbvCI is een heterodimeer restrictie-enzym dat een asymmetrische sequentie herkent. De subeenheden zijn afzonderlijk inactief, maar samen actief. Dit maakt het mogelijk specifieke nikkelenzymen te creëren door één subeenheid te inactiveren met behulp van gerichte mutagenese, zoals gerapporteerd door G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Litouwen) verkreeg een soortgelijk resultaat voor het heterodimerische restrictie-enzym Bpu10I. Hij is er ook in geslaagd de substraatspecificiteit te versoepelen van Eco57I, een monomeer restrictie- en modificatie-enzym, dat een enkel doelherkenningsdomein heeft. In deze studie werd willekeurige mutagenese gebruikt om een variant te genereren die niet alleen interacteert met de canonieke CTGAAG site, maar ook met CTGGAG sites. De moleculaire basis van deze verslapte specificiteit moet nog worden vastgesteld. V. Siksnys (Vilnius, Litouwen) deed verslag van de ontdekking van een nieuw type IIs restrictie-enzym, BfiI, dat voor splitsing niet afhankelijk is van divalente metaalionen. Dit enzym vertoont sequentieovereenkomst met een niet-specifiek nuclease van Salmonella typhimurium en maakt vermoedelijk gebruik van een soortgelijk katalytisch mechanisme.
A. Pingoud (Giessen, Duitsland) besprak het mechanisme van DNA-splitsing door type II restrictie-enzymen en homing endonucleasen, die een gemeenschappelijke functie hebben, maar in het algemeen verschillende structuren hebben en vermoedelijk verschillende splitsingsmechanismen volgen. Ondanks het feit dat gedetailleerde structuurinformatie beschikbaar is voor veel restrictie-enzymen die een gemeenschappelijk katalytisch motief delen, bestaat er geen consensus over het katalytische mechanisme of het aantal Mg2+ ionen dat bij de katalyse betrokken is. Hetzelfde geldt in principe voor andere fosforyltransferasen met een restrictie-enzym-achtig katalytisch centrum. Voorbeelden van dergelijke eiwitten zijn het Vsr-reparatie-enzym (E. coli) en het Hjc-resolvase (Pyrococcus furiosus). De kristalstructuur van dit laatste werd gepresenteerd door K. Morikawa (Osaka, Japan) (figuur3).3). Daarentegen lijkt het mechanisme van DNA-splitsing door de homing endonucleasen van de HNH-familie, b.v. I-PpoI, beter te zijn vastgesteld, omdat structurele informatie beschikbaar is voor zowel het vrije enzym als de enzym-substraat- en enzym-productcomplexen, naast gedetailleerde biochemische informatie voor dit en verwante enzymen van de “ββα-Me finger” superfamilie. Deze enzymen hebben een Mg2+-ion nodig als cofactor, dat gebonden is aan een geconserveerd Asn. Het aanvallende hydroxyl-ion wordt gegenereerd door een geconserveerde His, voor de stabilisatie van de overgangstoestand is een geconserveerde Arg nodig en de protonering van de vertrekkende groep wordt verzorgd door een watermolecuul uit de hydratatiesfeer van het Mg2+ ion.
Fig. 3. Vergelijking van de restrictie-endonuclease vouwen van Hjc en Vsr als een voorbeeld van behoud van structuren voor enzymen met verwante functies. De lintdiagrammen van Hjc en Vsr zijn weergegeven in dezelfde oriëntatie na superpositie van de twee structuren. De zijketens van de actieve site residuen zijn gemarkeerd, en de twee geconserveerde Asp residuen zijn gelabeld. Deze figuur werd vriendelijk ter beschikking gesteld door T. Nishino en K. Morikawa.
Bacteriën hebben RM-systemen ontwikkeld om bacteriofagen te bestrijden. Deze hebben op hun beurt verschillende middelen ontwikkeld om te ontsnappen aan de beperking door bacteriële RM-systemen. D. Dryden (Edinburgh, UK) rapporteerde de resultaten van een biochemische analyse van het gen 0.3 proteïne van bacteriofaag T7, dat een remmer is van type I restrictie-modificatie-enzymen. Dit eiwit bindt stoichiometrisch aan het restrictie-enzym en vult, vanwege zijn langgerekte vorm en negatieve oppervlaktelading, vermoedelijk volledig de DNA-bindingsplaats van het enzym en voorkomt daardoor DNA-binding.
RM-systemen bestaan uit restrictie-endonucleasen en DNA-methyltransferasen (MTasen) (besproken in Cheng, 1995; Robertson en Wolffe, 2000). Echter, omdat het patroon van DNA methylering informatie aan het DNA toevoegt en daarmee de coderingscapaciteit ervan uitbreidt, zijn MTases niet alleen de metgezellen van restrictie-enzymen in RM systemen, maar hebben ze vele andere vitale functies. In prokaryoten spelen ze een rol bij DNA-reparatie en de regulatie van genexpressie en DNA-replicatie. Bij eukaryoten leidt DNA-methylering over het algemeen tot het uitschakelen van genen in de transcriptie. Het draagt bij tot epigenetische processen zoals inactivering van het X-chromosoom, inprenting en genregulatie. Met de ontdekking dat verschillende DNA MTases essentieel zijn voor de ontwikkeling bij muizen, is het belang van DNA methylering algemeen aanvaard.
X. Cheng (Atlanta, GA) presenteerde de structuur van het Dnmt2 eiwit, wat de eerste structuur van een eukaryotisch DNA MTase zou kunnen zijn. Het eiwit heeft een MTase vouwing en bezit alle karakteristieke katalytische motieven, maar lijkt verstoken te zijn van enige katalytische activiteit. Dit roept vragen op zoals of het wel een enzym is en wat zijn substraat eigenlijk is (DNA, RNA of iets anders). Verdere besprekingen van eukaryote enzymen door Cheng en A. Jeltsch (Giessen, Duitsland) hadden betrekking op de enzymen Dnmt1, Dnmt3a en Dnmt3b. Beide sprekers meldden resultaten die waren verkregen met afgeknotte eiwitten en geïsoleerde domeinen van deze enorme enzymen (die tot 1700 aminozuurresiduen omvatten), en presenteerden resultaten betreffende de enzymatische analyse van gezuiverde enzymen. Aangezien het katalytische domein van Dnmt1 (∼500 aminozuurresiduen) in geïsoleerde vorm niet actief is, moet het onder strenge controle staan van andere delen van het enzym. Deze interactie zou nodig kunnen zijn om een hoge specificiteit voor hemimethylated DNA te garanderen. Ondanks de vooruitgang op dit gebied is het proces van DNA-methylering bij eukaryoten, met name de mechanismen die het patroon van DNA-methylering tot stand brengen, nog steeds slecht begrepen.
Er is iets meer bekend over DNA-methylering bij prokaryoten. R. Gumport (Urbana, IL) presenteerde de structuur van het prokaryote M.RsrI MTase, waarmee de veronderstelling wordt bevestigd dat de katalytische domeinen van alle MTases een gemeenschappelijke architectuur hebben. S. Klimasauskas (Vilnius, Litouwen), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport en Jeltsch bespraken de moleculaire enzymologie van vier prokaryote MTases (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI en M.EcoRV). De katalytische cyclus van deze enzymen omvat binding van DNA en cofactoren, lokalisatie en herkenning van de doelplaats, en conformatieveranderingen van het complex, waaronder base flipping en methylgroep overdracht (figuur4).4). Verschillen in detail werden duidelijk; b.v. de volgorde van substraat- en cofactorbinding en de snelheidsbeperkende stap verschilt in verschillende MTases. 2-aminopurine bleek een goed hulpmiddel te zijn voor het analyseren van de kinetiek van de conformatieveranderingen die het DNA ondergaat in complex met MTases, waaronder base flipping.
Fig. 4. Mechanisme van doelwitlocatie door restrictie-endonucleasen en DNA-methyltransferasen. Eerst wordt DNA niet-specifiek gebonden, vervolgens wordt de doellocatie gelokaliseerd door gefaciliteerde diffusie (glijden en hoppen) op het DNA. Contacten met de doelsites leiden tot conformatieveranderingen van het enzym en het DNA, die op hun beurt de katalyse op gang brengen. Dit mechanisme is gebruikelijk bij de meeste enzymen die specifiek met DNA interageren.