Translatie is een proces waarbij een aminozuurketen wordt gesynthetiseerd uit een mRNA-blauwdruk. Deze polypeptideketens vouwen zich tot functionele eiwitten. De translatie vindt buiten de kern plaats wanneer de nucleaire verwerking van het pre-mRNA is voltooid en de mRNA-moleculen via kernpoorten naar het cytoplasma zijn getransporteerd. De translatie wordt hoofdzakelijk vergemakkelijkt door ribosomen die zich bevinden op het ruwe endoplasmatische reticulum, op het buitenoppervlak van de nucleaire enveloppe, of in het cytoplasma.
- Initiation
- Elongation
- Termination
- Recycling
Een aantal moleculaire componenten spelen een rol bij translatie, waarvan het ribosoom de meest prominente is. Dit macromoleculaire complex is opgebouwd uit meerdere eiwitten en rRNA-moleculen. Alle ribosomen hebben een kleine en een grote subeenheid, maar de samenstelling van deze subeenheden verschilt aanzienlijk van soort tot soort. Bij de mens, bijvoorbeeld, bestaat de kleine 40S subeenheid uit 33 eiwitten en een enkele 18S rRNA molecuul, terwijl de grote 60S subeenheid bestaat uit 47 eiwitten en drie rRNAs (5S, 5.8S en 28S).
Ondanks de identificatie van 80 eiwitten geassocieerd met het menselijke ribosoom, worden er slechts 34 gevonden in andere eukaryoten of prokaryoten. Terwijl algemene functies zijn voorgesteld aan ribosoom geassocieerde eiwitten, zoals stabilisatie van het complex en regulering van de vertaling, zijn sommige ook toegeschreven aan de co-translationele modificatie van nieuw gesynthetiseerde eiwitten (herzien in ).
Elongatie
In tegenstelling tot de initiatie, terminatie en ribosoom recycling fasen van de vertaling, zijn de mechanismen die elongatie aandrijven in hoge mate geconserveerd tussen eukaryoten en bacteriën (herzien in ).
Codon herkenning
Elongatie vindt plaats in een aantal welomschreven stappen, beginnend met de herkenning van de mRNA codons door hun corresponderende aminoacyl-tRNA. Associatie met het mRNA vindt plaats via de ribosomale A site en wordt beïnvloed door verschillende elongatiefactoren. Zo levert het GTPase eEF1A aminoacyl-tRNA’s aan de A-locatie na te zijn geactiveerd door eEF1B, een guaninenucleotide-uitwisselingsfactor (GEF) die de dissociatie van GDP van eEF1A versnelt.
Peptidebindingvorming
Na herkenning van het mRNA codon ontstaat een peptidebinding tussen het aminoacyl-tRNA en het peptidyl-tRNA (dat zich in de ribosomale P-site bevindt). Deze reactie wordt vergemakkelijkt door peptidyltransferase, dat zelf geen eiwit is, maar een zeer geconserveerd ribosomaal RNA. Het mechanisme van peptide binding vorming impliceert conformatie veranderingen op de actieve plaats in plaats van chemische katalyse door ribosomale groepen en wordt gedreven door gunstige entropie verandering .
Translocatie van het mRNA en tRNAs door het ribosoom
Zodra de peptide binding is gevormd, wordt de A-site vrijgemaakt wanneer het peptidyl-tRNA dat het bezet naar de P-site van de grote ribosomale subeenheid beweegt, gelijktijdig een bestaand gedeacyleerd tRNA vervangend dat naar de E-site beweegt voordat het het ribosoom verlaat . Naarmate de aminozuurketen groeit, en de A- en P-locaties tijdelijk worden bezet door respectievelijk nieuwe aminoacyl- en peptidyl-tRNA’s, vindt een translocatie van het mRNA door het ribosoom plaats.
Twee mechanismen, die worden gekenmerkt door conformatieveranderingen in de ribosomale subeenheden, vergemakkelijken de translocatie van mRNA en tRNA. Deze staan bekend als ‘ratcheting’ en ‘swiveling’.
Ratcheting wordt waargenomen in alle stadia van translatie, en ziet de kleine ribosomale subeenheid een lichte rotatie ondergaan, van ongeveer ~8° ten opzichte van de grote subeenheid (besproken in ). Dit is te onderscheiden van zwenken, waarbij het hoofddomein (30S) van de kleine subeenheid wordt bewogen. Belangrijk is dat zwenken een rol speelt bij de intrinsieke helicase-activiteit van het ribosoom, die belangrijk is voor het afwikkelen van secundaire mRNA-structuren.
Deze mechanismen zorgen er uiteindelijk voor dat het tRNA op een sequentiële (A-site naar P-site naar E-site) manier beweegt, en maken de vorming mogelijk van de tussentoestanden waarvan bekend is dat ze tijdens mRNA-tRNA translocatie bestaan. Deze toestanden, die ook hybride toestanden worden genoemd, kunnen worden beschreven met het eukaryotische model als voorbeeld. Hier bewegen de 3′ uiteinden van het tRNA, die de A- en P-locaties bezetten, zich naar de P- en E-locaties in de 60S-subeenheid, terwijl de 5′ uiteinden, die met het mRNA geassocieerd zijn, verankerd blijven aan respectievelijk de A- en P-locaties van de 40S-subeenheid.
Deze hybride toestanden worden tijdelijk gestabiliseerd door de binding van eEF2-GTP (EF-G – GTP in prokaryoten) aan de ribosomale A-locatie. Hydrolyse van het GTP echter, gemedieerd door de GTPase activiteit van het EF-G of eukaryotische homoloog eEF2, laat het ratcheting mechanisme doorgaan, en zorgt ervoor dat het mRNA en de 5′ uiteinden van het tRNA van de A en P-sites naar respectievelijk de P en E-sites gaan. Zodra de canonieke A/A, P/P, E/E (60S/40S) conformatie is hersteld, dissocieert het EF-G – GDP van het ribosoom, waardoor de A-plaats open blijft om een nieuw aminoacyl-tRNA-molecuul te ontvangen.
GTP hydrolyse door EF-G / eEF2, en de daaropvolgende zwenking van het hoofddomein helpt verder bij tRNA translocatie door het voorkomen van spontane achterwaartse beweging van tRNA .
Initiëring van translatie
De eerste stap in translatie staat bekend als initiatie. Hier worden de grote (60S) en kleine (40S) ribosomale eenheden geassembleerd tot een volledig functioneel 80S ribosoom. Dit wordt gepositioneerd op het startcodon (AUG) van de te vertalen mRNA-streng (besproken in ).
Initiatie wordt beschouwd als de snelheidsbeperkende stap in het totale proces en wordt voornamelijk gereguleerd, en gecoördineerd, door een groep eiwitten die bekend staan als eukaryotische initiatiefactoren (eIF’s) . Deze factoren variëren in grootte en complexiteit; van de enkele 113kDa eIF1 subeenheid tot het 700kDa eIF3 complex. Bij de mens werken ten minste 12 eIFs samen om de initiatie te reguleren, elk met een eigen rol, die uitvoerig zijn besproken in .
De initiatie begint met de vorming van een ternair complex dat bestaat uit eIF2, GTP en het initiator tRNA (Met-tRNAi). De primaire rol van het ternaire complex is de initiator af te leveren aan de 40S-subeenheid, die vervolgens een 43S-complex vormt, ook wel het PIC (pre-initiatiecomplex) genoemd. Met de hulp van eIF4G en eIF3 bindt het PIC op of dicht bij de 5′-terminus van het mRNA. Dit wordt gemarkeerd door een 7-methylguanosine cap (m7-G-cap). Eenmaal gebonden scant de PIC de 5′-onvertaalde regio om het initiatiecodon te lokaliseren.
De leader-sequentie van de 5′-terminus wordt in een afgewikkelde toestand gehouden door de helicase-activiteit van diverse eIFs (waaronder eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF4B, eIF3). Zodra de 40S subeenheid op het initiatiecodon is geplaatst, wordt de 60S subeenheid gerekruteerd om een elongatie-competent 80S ribosoom te vormen. Op dit punt is het mRNA-startcodon gelokaliseerd in de ribosomale P-site, en het hele initiatiecomplex is klaar om de elongatiefase in te gaan.
Het is belangrijk op te merken dat de 40S subeenheid zich onafhankelijk van de m7-G-kap aan het mRNA kan binden. Het meest prominente voorbeeld hiervan, waarvan wordt aangenomen dat het in 5-10% van de cellulaire mRNA’s voorkomt, betreft de binding van de 40S-subeenheid aan een interne ribosoom-entry-site (IRES) . Andere m7-G-cap onafhankelijke initiatiewegen zijn shunting , tethering , translation enhancers , een TISU-element , en een poly-adenylaat leider in de 5′-terminus.
Ribosoom Recycling
De laatste stap in de translatie is ribosoom recycling, waarbij het ribosoom splitst in zijn kleinere subeenheden en zich voorbereidt op een nieuwe translatieronde. Bij eukaryoten betekent dit dat het 80S ribosoom zich splitst in zijn 40S en 60S subeenheden. Hoewel deze stap de voltooiing van het translatieproces markeert, kan hij ook om een aantal andere redenen plaatsvinden, bijvoorbeeld wanneer de synthese van de polypeptideketen mislukt, wanneer beschadigd mRNA wordt aangetroffen, of na de assemblage van lege ribosomen. Bovendien wordt deze stap vaak beschreven als het begin van de initiatie, waarbij het sleuteleiwit dat de splitsing van ribosomen vergemakkelijkt, ook associeert met verschillende initiatiefactoren (van ABCE1 is aangetoond dat het associeert met eIF2, eIF3 en eIF5 in gistmodellen).
In eukaryoten wordt ribosoomrecycling voornamelijk gefaciliteerd door ABCE1 (Rli1 in gist), dat lid is van de ABC-superfamilie van ATPasen. Dit eiwit, dat twee nucleotide bindende domeinen en een uniek FeS1 clusterdomein bezit, bindt zich aan het post-terminatie complex zodra het RF3-GDP is losgemaakt van het ribosoom. Deze associatie ontstaat door de interactie tussen de FeS-cluster en eRF1. Belangrijk is dat ACBE1 ook talrijke bindingsplaatsen bevat die interacties mogelijk maken tussen ribosomale subeenheden, en verschillende ribosomale eiwitten. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat een HLH-motief in het eerste nucleotide bindende domein bindt aan zowel het 18S rRNA als aan rpS24-A . Hoewel het exacte mechanisme dat ribosomale splitsing aanstuurt onduidelijk blijft, wordt voorgesteld dat dit bij eukaryoten het resultaat is van een conformatieverandering in ABCE1 die wordt geïnduceerd door ATP-hydrolyse.
Zoals eerder vermeld, is peptide-vrijgave geen voorwaarde voor de dissociatie van ribosomale subeenheden of voor binding van ABCE1 . Dit is belangrijk wanneer ribosoom recycling wordt geïnduceerd in reactie op mRNA schade of de assemblage van lege ribosomen, omdat er geen stop-codon zal worden gedetecteerd om terminatie en peptide vrijgave te initiëren. Om dit te ondervangen is ABCE1 in staat om peptide-afgifte te faciliteren op een vergelijkbare manier als het eRF1-eRF3-GTP ternaire complex, en er is aangetoond dat dit onafhankelijk van ATP hydrolyse gebeurt. ATP-hydrolyse induceert hier een conformatieverandering in eRF1 die peptidyl-tRNA-hydrolyse bevordert.
Belangrijk is dat eRF1 en eRF3 voldoende kunnen zijn om dissociatie van de subeenheid te initiëren; dit zal echter met een langzamere snelheid gebeuren .
De mechanismen van recycling in prokaryoten zijn verschillend van die in eukaryoten, met als belangrijkste verschil de aanwezigheid van gespecialiseerde ribosoom recycling factor (RRF) die samen met EF-G werkt om de ribosomale subeenheden in bacteriën te scheiden .
Beëindiging van de vertaling
De volgende stap in het proces van vertaling is beëindiging. In deze stap geeft een mRNA-stopcodon aan dat er geen extra aminozuren aan het groeiende eiwit moeten worden toegevoegd. Beëindiging in eukaryoten wordt vergemakkelijkt door slechts twee factoren (eRF1 en eRF3) en verschilt aanzienlijk van het proces in prokaryoten, waarbij drie factoren betrokken zijn (RF1, RF2 en RF3). In eukaryoten moeten twee verschillende processen plaatsvinden om de peptide-elongatie met succes te kunnen beëindigen: het vrijkomen van peptiden en de totstandkoming van het post-terminatiecomplex. In sommige gevallen, wanneer de translatie moet eindigen vóór de detectie van een stopcodon, kan de terminatiestap worden overgeslagen en kan de ribosoomrecycling vroegtijdig worden gestart. In dit geval zal de peptide-vrijgave worden vergemakkelijkt door ABCE1.
Terminatie wordt in gang gezet door de invoer van een stopcodon (UAA, UGA of UAG) in de ribosomale A-site. Dit codon wordt herkend door een klasse 1 releasefactor (RF1). In eukaryoten bindt deze factor (eRF1) zich aan het ribosoom als onderdeel van een vooraf geassembleerd ternair complex dat bestaat uit eRF1, eRF3 en GTP . De stop-codon wordt herkend door een geconserveerd motief dat zich aan het amino-terminale uiteinde van het eiwit bevindt, zoals het NIKS motief .
eRF1 helpt ook bij peptidyl-tRNA hydrolyse en peptide-vrijgave uit het peptidyl transferase centrum (PTC). Dit gebeurt als gevolg van GTP-hydrolyse door eRF3, dat een conformatieverandering in eRF1 induceert waardoor zijn Gly-Gly-Gln (GGQ) motief, dat zich in het ‘middelste’ (M) domein bevindt, het ribosomale PTC kan binnendringen en peptidyl-tRNA hydrolyse vergemakkelijkt. Dit mechanisme verschilt in prokaryoten, waar peptide-vrijgave vereist is voor, en dus voorafgaat aan, GTP-hydrolyse door RF3 .
Na GTP hydrolyse en peptide vrijgave, zal de RF3-GDP dissociëren van het eiwit, achterlatend RF1, dat gebonden blijft aan het ribosoom in wat bekend staat als het post-terminatie complex . Dit maakt het ribosoom in wezen klaar voor ribosomale recycling.