Sistemas de restricción-modificación
Los sistemas de restricción-modificación (MR) se encuentran de forma ubicua en el reino procariota donde sirven como sistemas de defensa contra el ADN extraño. Actualmente se conocen 47 sistemas de tipo I, 3320 de tipo II y ocho de tipo III. R. Roberts (Beverly, MA) señaló que, hasta hace poco, las enzimas de restricción se habían identificado obteniendo bacterias de colecciones de cultivos y muestras ambientales y analizándolas en busca de actividad de restricción. Ahora es posible examinar nuevas secuencias de ADN en busca de genes de metiltransferasa de ADN (MTasa), que pueden identificarse por sus motivos conservados, y luego buscar genes asociados. Estos son buenos candidatos para los genes de las endonucleasas de restricción, porque los genes de las metiltransferasas de ADN y de las endonucleasas de restricción suelen estar relacionados. Recientes proyectos genómicos han identificado un número inesperado de sistemas putativos de MR de esta manera. Por ejemplo, se identificaron 25 genes diferentes de MTasa en el genoma de Helicobacter pylori, y algunos de ellos estaban asociados a genes de enzimas de restricción. El cribado de las bases de datos puede, por tanto, convertirse en un método muy productivo para encontrar enzimas de restricción con nuevas especificidades. A. Piekarowicz (Varsovia, Polonia) informó sobre un ejemplo de este enfoque que condujo a la identificación de una nueva enzima de restricción de tipo IC, NgoAXVI.
Las enzimas de restricción de tipo I y de tipo III, así como la enzima McrBC dependiente de metilo, requieren dos sitios de reconocimiento y dependen de la hidrólisis de ATP (McrBC: GTP) para la escisión del ADN (revisado en Rao et al., 2000). La escisión se produce cuando dos de estas enzimas chocan al translocar el ADN, lo que explica el requisito de dos sitios (Figura2).2). T. Bickle (Basilea, Suiza) demostró que las enzimas de tipo I y McrBC también pueden ser estimuladas para escindir el ADN cuando se encuentran con un bloqueo no específico. Las enzimas de tipo III, por el contrario, se ven inhibidas por dichos bloqueos, ya que cada enzima de translocación corta sólo una hebra y requiere la cooperación de otra enzima para escindir ambas hebras de ADN.
Fig. 2. Modelo para la activación de las enzimas de restricción que requieren ATP (o GTP) para la escisión del ADN. Tras la unión de dos moléculas de enzima (o complejos) a dos sitios de reconocimiento en una molécula de ADN lineal, el ADN se transporta en un proceso activo, dependiente de la energía, que requiere ATP o GTP, dependiendo del sistema. De este modo, el ADN se desprende en forma de bucle. El corte se produce tras la colisión de dos complejos de translocación, en sitios aleatorios en las proximidades de los sitios de reconocimiento (enzimas de tipo III y McrBC) o más alejados de ellos (enzimas de tipo I).
Aunque la mayoría de las enzimas de restricción de tipo II son homodímeros que interactúan con una copia de su sitio de reconocimiento palindrómico, existen subtipos que requieren la cooperación de dos sitios (revisado en Pingoud y Jeltsch, 1997). Como ha señalado S. Halford (Bristol, Reino Unido), éste es el caso no sólo de las enzimas de tipo IIe, como NaeI, sino también de las enzimas de tipo IIf, como SfiI, y de las enzimas de tipo IIS, como FokI. Las enzimas de tipo IIf son homotetrámeros con dos sitios de unión al ADN separados, cada uno formado por dos subunidades. SfiI sólo es activa cuando ambos sitios de unión al ADN están ocupados, lo que conduce a una escisión simultánea de ambos sitios. En el caso de FokI, que consta de un dominio de escisión y otro de reconocimiento, se demostró anteriormente que la dimerización de la enzima en el ADN es necesaria para que se produzca la escisión. Halford ha demostrado ahora que se necesitan dos sitios de reconocimiento para que la escisión sea eficaz, ya que cada uno de los dominios de reconocimiento debe interactuar con una secuencia de reconocimiento. Los tres tipos de enzimas actúan de forma óptima con dos sitios en el mismo ADN, donde atrapan el ADN entre los sitios en un bucle.
Se siguen descubriendo enzimas de restricción de tipo II atípicas. BbvCI es una enzima de restricción heterodimérica que reconoce una secuencia asimétrica. Las subunidades son inactivas individualmente, pero activas conjuntamente. Esto permite crear enzimas de mellado específicas inactivando una subunidad mediante mutagénesis dirigida al sitio, como informó G. Wilson (Beverly, MA). A. Janulaitis (Vilnius, Lituania) obtuvo un resultado similar para la enzima de restricción heterodimérica Bpu10I. También consiguió relajar la especificidad de sustrato de Eco57I, una enzima de restricción y modificación monomérica, que tiene un único dominio de reconocimiento de diana. En este estudio, se utilizó la mutagénesis aleatoria para generar una variante que interactúa no sólo con el sitio CTGAAG canónico, sino también con los sitios CTGGAG. La base molecular de esta especificidad relajada aún está por determinar. V. Siksnys (Vilnius, Lituania) informó del descubrimiento de una nueva enzima de restricción de tipo IIs, BfiI, que no depende de los iones metálicos divalentes para la escisión. Esta enzima muestra similitud de secuencia con una nucleasa no específica de Salmonella typhimurium y presumiblemente utiliza un mecanismo catalítico similar.
A. Pingoud (Giessen, Alemania) discutió el mecanismo de escisión del ADN por parte de las enzimas de restricción de tipo II y las endonucleasas homing, que comparten una función común, pero en general tienen estructuras diferentes y presumiblemente siguen mecanismos de escisión distintos. A pesar de que se dispone de información detallada sobre la estructura de muchas enzimas de restricción que comparten un motivo catalítico común, no hay consenso sobre el mecanismo catalítico o el número de iones Mg2+ que intervienen en la catálisis. En principio, lo mismo ocurre con otras fosforil transferasas con un centro catalítico similar al de las enzimas de restricción. Ejemplos de tales proteínas son la enzima de reparación Vsr (E. coli) y la resolvasa Hjc (Pyrococcus furiosus). La estructura cristalina de esta última fue presentada por K. Morikawa (Osaka, Japón) (Figura3).3). En cambio, el mecanismo de escisión del ADN por parte de las endonucleasas homing de la familia HNH, por ejemplo I-PpoI, parece estar mejor establecido, ya que se dispone de información estructural para la enzima libre, así como para los complejos enzima-sustrato y enzima-producto, además de información bioquímica detallada para ésta y otras enzimas relacionadas de la superfamilia «ββα-Me finger». Estas enzimas requieren un ion Mg2+ como cofactor que se une a un Asn conservado. El ion hidroxilo atacante es generado por un His conservado, la estabilización del estado de transición implica un Arg conservado y la protonación del grupo saliente es proporcionada por una molécula de agua de la esfera de hidratación del ion Mg2+.
Fig. 3. Comparación de los pliegues de las endonucleasas de restricción de Hjc y Vsr como ejemplo de conservación de estructuras para enzimas con funciones relacionadas. Los diagramas de cinta de Hjc y Vsr se muestran en la misma orientación tras la superposición de las dos estructuras. Las cadenas laterales de los residuos del sitio activo están resaltadas y los dos residuos Asp conservados están etiquetados. Esta figura ha sido amablemente facilitada por T. Nishino y K. Morikawa.
Las bacterias han desarrollado sistemas de MR para luchar contra los bacteriófagos. Estos, a su vez, han desarrollado diversos medios para escapar de la restricción de los sistemas de MR bacterianos. D. Dryden (Edimburgo, Reino Unido) informó de los resultados de un análisis bioquímico de la proteína 0.3 del bacteriófago T7, que es un inhibidor de las enzimas de modificación de la restricción de tipo I. Esta proteína se une estequiométricamente a la enzima de restricción y, debido a su forma alargada y a su carga superficial negativa, presumiblemente llena por completo el sitio de unión del ADN de la enzima y, por tanto, impide la unión del ADN.
Los sistemas de modificación de restricción consisten en endonucleasas de restricción y metiltransferasas de ADN (MTas) (revisado en Cheng, 1995; Robertson y Wolffe, 2000). Sin embargo, como el patrón de metilación del ADN añade información al ADN y, por tanto, amplía su capacidad de codificación, las MTasas no son sólo las compañeras de las enzimas de restricción en los sistemas de MR, sino que tienen muchas otras funciones vitales. En procariotas, desempeñan papeles en la reparación del ADN y en la regulación de la expresión génica y la replicación del ADN. En los eucariotas, la metilación del ADN suele provocar el silenciamiento transcripcional de los genes. Contribuye a procesos epigenéticos como la inactivación del cromosoma X, la impronta y la regulación génica. Con el descubrimiento de que varias MTasas del ADN son esenciales para el desarrollo en los ratones, la importancia de la metilación del ADN ha sido ampliamente aceptada.
X. Cheng (Atlanta, GA) presentó la estructura de la proteína Dnmt2, que podría ser la primera estructura de una MTasa de ADN eucariótica. La proteína tiene un pliegue de MTasa y posee todos los motivos catalíticos característicos, pero parece carecer de toda actividad catalítica. Esto plantea cuestiones como si se trata realmente de una enzima y cuál es su sustrato (ADN, ARN u otra cosa). Otras discusiones sobre enzimas eucariotas a cargo de Cheng y A. Jeltsch (Giessen, Alemania) trataron sobre las enzimas Dnmt1, Dnmt3a y Dnmt3b. Ambos ponentes informaron de los resultados obtenidos con proteínas truncadas y dominios aislados de estas enormes enzimas (que comprenden hasta 1700 residuos de aminoácidos), además de presentar resultados relativos al análisis enzimático de enzimas purificadas. Dado que el dominio catalítico de la Dnmt1 (∼500 residuos de aminoácidos) no es activo en forma aislada, debe estar bajo un estrecho control de otras partes de la enzima. Esta interacción podría ser necesaria para asegurar una alta especificidad para el ADN hemimetilado. A pesar de los avances en este campo, el proceso de metilación del ADN en eucariotas, en particular los mecanismos que crean el patrón de metilación del ADN, sigue siendo poco conocido.
Se sabe algo más sobre la metilación del ADN en procariotas. R. Gumport (Urbana, IL) presentó la estructura de la MTasa M.RsrI procariótica, confirmando la conjetura de que los dominios catalíticos de todas las MTasas comparten una arquitectura común. S. Klimasauskas (Vilnius, Lituania), D.N. Rao (Bangalore, India), Gumport y Jeltsch discutieron la enzimología molecular de cuatro MTasas procariotas (M.HhaI, M.EcoP15, M.RsrI y M.EcoRV). El ciclo catalítico de estas enzimas implica la unión del ADN y del cofactor, la localización y el reconocimiento del sitio diana y los cambios conformacionales del complejo, incluyendo el volteo de bases y la transferencia del grupo metilo (Figura (Figura4).4). Las diferencias en los detalles se hicieron evidentes; por ejemplo, el orden de unión del sustrato y el cofactor y el paso que limita la velocidad difieren en varias MTasas. La 2-aminopurina demostró ser una buena herramienta para analizar la cinética de los cambios conformacionales que sufre el ADN en complejo con las MTasas, incluyendo el volteo de bases.
Fig. 4. Mecanismo de localización del sitio diana por parte de las endonucleasas de restricción y las metiltransferasas de ADN. En primer lugar, el ADN se une de forma no específica y, a continuación, el sitio diana se localiza por difusión facilitada (deslizamiento y salto) en el ADN. Los contactos con los sitios diana inducen cambios conformacionales de la enzima y del ADN que, a su vez, desencadenan la catálisis. Este mecanismo es común entre la mayoría de las enzimas que interactúan específicamente con el ADN.