O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é um ensaio imunológico comumente usado para medir anticorpos, antígenos, proteínas e glicoproteínas em amostras biológicas. Alguns exemplos incluem: diagnóstico de infecção pelo HIV, testes de gravidez e medição de citocinas ou receptores solúveis no sobrenadante celular ou soro. Os ensaios ELISA são geralmente realizados em 96 placas de poços, permitindo que múltiplas amostras sejam medidas em um único experimento. Estas placas precisam de ser placas absorventes especiais (por exemplo, placas NUNC Immuno) para garantir que os anticorpos ou antigénios se fixam à superfície. Cada ELISA mede um antigénio específico, e estão amplamente disponíveis kits para uma variedade de antigénios.
O ELISA representado na Figura 1 é o chamado ELISA em sanduíche, aqui são utilizados dois conjuntos de anticorpos para detectar produtos secretados, por exemplo citocinas. O método é escalonado na ordem apresentada. O primeiro passo é revestir a placa ELISA com anticorpos de captura, qualquer excesso de anticorpos não ligados é então lavado da placa. O anticorpo de captura é um anticorpo levantado contra o antígeno de interesse.
Figure 1. Método ELISA. Descrito acima é um ELISA em sanduíche, mostrando os passos no ensaio, numerados na ordem 1-4.
Próximo a amostra (por exemplo, urina, soro, ou sobrenadante celular) é adicionado. Qualquer antigénio encontrado na amostra irá ligar-se ao anticorpo de captura que já esteja a revestir a placa. As amostras são normalmente adicionadas em duplicado ou triplicado (para permitir a análise estatística), e em concentrações variáveis para garantir que se enquadra nos níveis de detecção do ensaio. Novamente qualquer amostra em excesso é lavada da placa.
No passo 3, o anticorpo de detecção é adicionado. Este anticorpo é rotulado com uma enzima, geralmente peroxidase de rabanete de cavalo ou fosfatase alcalina. O anticorpo de detecção liga-se a qualquer antígeno alvo já ligado à placa. Finalmente, um substrato é adicionado à placa. Os ensaios ELISA são normalmente cromogénicos usando uma reacção que converte o substrato (por exemplo, TMB ou ABTS) num produto colorido que pode ser medido usando um leitor de placas.
Determinação da concentração de antigénio numa amostra requer a produção de uma curva padrão usando antigenes de uma concentração conhecida (mostrados na Figura 2). A concentração de antígeno numa amostra pode então ser calculada utilizando a densidade óptica (DO).
Figure 2. Uma curva padrão típica. Mostrada é uma curva padrão para um IFN-γ ELISA. Para calcular a concentração de antígeno numa amostra, é necessário preparar uma curva padrão utilizando uma solução de concentração conhecida.