5.5.9 Ciclul acidului tricarboxilic
Piruvatul se află la punctul de ramificare a secvenței catabolice a metabolismului oxidativ al glucozei în ciclul TCA și a căii gluconeogene din precursorii C3. În ambele căi, piruvatul intră în ciclul TCA, unde este fie decarboxilat oxidativ în acetil-CoA prin intermediul piruvatului dehidrogenazei, fie carboxilat în oxaloacetat în reacția piruvatului carboxilază. Deoarece PC și PDH sunt în competiție pentru piruvat, acestea se află în poziții cheie pentru reglarea metabolismului anaplerotic (adică de reaprovizionare) și, respectiv, oxidativ. Cohen și colaboratorii (1979b; Cohen, 1983, 1987a,b,c) au folosit combinații de alanină sau piruvat marcate și nemarcate și etanol pentru a investiga competiția substratului hepatic pentru intrarea în ciclul TCA în diferite stări hormonale și dietetice ale ficatului de șobolan și de șoarece perfuzat.
Când alanina a fost singurul substrat hepatic, C2, C3 și C4 de glutamat și glutamină au fost ușor de marcat, așa cum era de așteptat din topologia ciclului TCA (Cohen et al., 1979b; Cohen, 1987a). Alanina este transaminată în piruvat, care este fie decarboxilat în acetil-CoA, fie carboxilat în oxaloacetat. Acetil-CoA este încorporat în citrat și, ulterior, în α-cetoglutarat, care, la rândul său, poate fi transaminat în glutamat. Pe de altă parte, oxaloacetatul se află în echilibru cu malatul și fumaratul (a se vedea secțiunea 5.5.8), iar eticheta este amestecată în C2 și C3 ale oxaloacetatului. Condensarea acestor izotopomeri de oxaloacetat cu acetil-CoA în reacția citrat-sintetazei dă naștere ulterior la – și α-cetoglutarat și, prin urmare, la – și glutamat. Prin urmare, proporția relativă de piruvat care intră în ciclul TCA prin PC și PDH poate fi estimată prin îmbogățirea relativă în glutamat C2 și C4. În ipoteza unui model de ordinul întâi, în care se ia în considerare doar o singură întoarcere a ciclului TCA și se neglijează reciclarea continuă a markerului (a se vedea secțiunea 5.3.7), Cohen (1983, 1987c) a calculat rapoarte ale ratei fluxului PC față de PDH care au variat de la 1,2 la 2,6 și, respectiv, 7,7 în ficatul de la șobolani donatori bine hrăniți, diabetici și, respectiv, hrăniți timp de 24 de ore. În ficatul diabetic, proporția relativă de piruvat canalizat în ciclul TCA prin cele două căi alternative nu a fost modificată de incubarea in vitro cu insulină.
În contrast cu experimentele în care alanina a fost singurul substrat pentru metabolismul hepatic, coadiția etanolului neetichetat a dus la obținerea de glutamat C4 și glutamină C4 practic lipsite de etichetă (Cohen et al., 1979b). Etanolul, care este ușor de oxidat de către alcool dehidrogenază în acetaldehidă și apoi în acetat, servește ca sursă suplimentară de acetil-CoA. Rezultatele au indicat că acetil-CoA derivată din etanol concurează eficient cu acetil-CoA care intră în ciclul TCA prin PDH. Astfel, în prezența unei surse alternative de acetil-CoA, alanina a intrat în ciclul TCA aproape exclusiv prin reacția PC. Mai mult, cosuplimentarea alaninei cu etanol a crescut rata de consum a alaninei prin reacția PC cu aproape 50% în comparație cu ficatul perfuzat doar cu alanină. Acest rezultat nu este neașteptat în lumina unei reacții PC care este reglată de nivelul de acetil-CoA. O concentrație ridicată de acetil-CoA, așa cum a fost disponibilă în urma metabolismului etanolului, a crescut fluxul prin PC pentru a mări rezerva de oxaloacetat pentru un consum accelerat de acetil-CoA în ciclul TCA. S-au efectuat experimente similare cu piruvat marcat + NH4C1 și etanol ca substraturi și s-au obținut rezultate echivalente (Cohen, 1987a,b). Mai mult, Nedelec și colab. (1990b) au utilizat modelul propus de Cohen (1983) pentru a evalua efectul leucemiei mieloproliferative induse de virus asupra metabolismului hepatic. S-a constatat că metabolismul alaninei în ficatul infectat al donatorilor aflați la post a fost similar cu cel al martorilor hrăniți. Ficatul ambelor grupuri a avut o contribuție redusă a PC față de PDH la fluxul de alanină în ciclul TCA în comparație cu controalele la post. Raportul modificat al fluxului PC/PDH în ficatul leucemic la post a fost explicat prin disponibilitatea drastic redusă a trigliceridelor și, prin urmare, a acetil-CoA în aceste organe.
13C MRS oferă posibilitatea unică de a urmări simultan metabolismul etanolului și alaninei (a se vedea figura 8). În experimentele în care alanina și etanolul au fost folosite ca surse de carbon, s-a produs acetil-CoA cu două modele de marcare diferite (Cohen, 1987b). La intrarea alaninei în ciclul TCA prin reacția PDH, se formează acetil-CoA și acetil-CoA este derivat din etanol. Pe lângă marcarea citratului, α-cetoglutaratului, glutamatului și glutaminei în pozițiile C4 și C5, încorporarea acetil-CoA dă naștere la cuplări de spin tipice între carbonații C4 și C5 vecini ai glutamatului și glutaminei, care se disting ușor de rezonanțele singlet generate de încorporarea alaninei. Prin urmare, o estimare directă a competiției dintre alanină și etanol poate fi obținută din analiza raportului singlet/multiplet în C4 al glutamatului. Analiza modelelor de cuplaj de spin a fost, de asemenea, utilă pentru atribuirea rezonanțelor de la glutation observate în spectrele RMN 13C obținute din ficat perfuzat (Cohen, 1987a). Modelele de cuplaj de spin detectate pentru fracțiunea glutamil din glutation în urma perfuziei ficatului cu precursori marcați cu 13C au corespuns îndeaproape cu modelul de marcare observat în glutamat. Astfel, s-a concluzionat că scheletul de carbon al glutamatului a rămas intact și a fost încorporat direct în glutationul sintetizat de novo. Deplasările chimice măsurate în extractele de PCA din ficat au indicat că glutationul este prezent în forma sa redusă.
În afară de glutamat, în multe experimente s-a observat marcarea glutaminei hepatice. Acest lucru nu este surprinzător deoarece glutamina se formează cu ușurință în reacția glutaminei sintetază. Cohen și colab. (1979b) au urmărit evoluția în timp a încorporării markerului în glutamatul și glutamina hepatică în ficatul de șoarece perfuzat în prezența alaninei și a etanolului marcat sau nemarcat. În toate condițiile investigate, îmbogățirea în glutamină a rămas în urma celei în glutamat, după cum reiese din raportul C4/C2 al intensităților semnalului 13C MR în glutamat și, respectiv, glutamină. Raportul C4/C2 observat în glutamină la un moment dat nu a fost același cu raportul corespunzător în glutamat, ci a reflectat în schimb raportul glutamatului de aproximativ 1 oră mai devreme. Această diferență de timp a fost utilizată ca o măsură a fluxului prin reacția de glutamină-sintetază controlată alosteric in vivo. Rezultate similare au fost obținute din ficatul de șobolan perfuzat cu acetat (Desmoulin et al., 1985; Canioni et al., 1985). Cu toate acestea, interpretarea marcării în glutamat și glutamină a fost realizată cu un pas mai departe. Autorii au sugerat că glutamatul și glutamina ar putea lua parte la un ciclu zadarnic, care cuprinde activitățile glutaminei sintetazei citosolice, glutaminazei mitocondriale și schimbul glutamat/glutamină prin membranele mitocondriale.
În ficatul la post, perfuzat cu alanină și etanol sau piruvat, clorură de amoniu și etanol, s-a putut observa aspartat și N-carbamoylaspartat marcate la C2 și C3 (Cohen, 1987a). Detectarea aspartatului marcat nu este neașteptată, deoarece acesta se formează cu ușurință prin transaminare a oxaloacetatului intermediar al ciclului TCA. Cu toate acestea, N-carbamoylaspartatul este produs în ficat în una dintre primele etape ale sintezei de novo a nucleotidelor pirimidinice. N-carbamoylaspartatul încorporează fracțiunea aspartat intactă, ceea ce duce la modelul de marcare observat. Detectarea ulterioară a markerului 13C în produsele finale ale căii, cum ar fi uridina și produsele sale de fosforilare, indică faptul că în ficatul perfuzat s-a observat o sinteză netă de N-carbamoylaspartat, spre deosebire de o reînnoire (Cohen, 1987a).
.