Patogenes In Vitro
Columnar epithelial cells are dead-end cells that experience two extremes of pH at once. Apikalt badar de i starkt alkaliska tarmvätskor och basalt badar de i svagt sur hemolymphe. Dessa förhållanden är svåra att efterlikna i cellodling, vilket kan förklara varför det finns så lite information om primärinfektion.
Cellinjer som stöder replikation av GV är sällsynta och finns för närvarande endast för CpGV. Följaktligen vet vi inte mycket mer om mekanismerna för GV-infektion än vad vi vet om ODV-infektion. Trots detta vet vi att under GV-nukleokapsidmorfogenesen sönderfaller värdcellens kärnmembran, en händelse som inte stör bearbetningen av nukleokapsidet. Försvinnandet av kärnmembranet är distinkt och förekommer inte i NPV-infekterade värdceller.
Ett antal insektscellinjer har etablerats som stöder NPV-infektioner. De flesta av cellinjerna härstammar från larvornas äggstockar eller embryon. AcMNPV kan replikera i cellinjer som härstammar från flera insektsarter, ett faktum som bidrar till att det är det bäst studerade baculoviruset. I en standardiserad tillväxtkurva i ett steg produceras AcMNPV BVs vanligtvis 12-20 timmar efter infektion (hpi), och ocklusioner 20-48 timmar efter infektion (hpi). Replikation av de flesta andra NPV i cellkultur tar timmar till dagar längre.
AcMNPV BV är 1000 gånger mer infektiöst än ODV, främst på grund av närvaron av dess fusionsprotein, GP64. BVs kommer in i sina målceller genom clathrinmedierad endocytos. BV-nukleokapsider tränger djupt in i målcellernas cytoplasma genom att frigöras från endosomer. Med hjälp av denna strategi kringgår nukleokapsiderna den eventuellt farliga miljö som ligger precis under plasmamembranet och kommer in i cellen närmare cellkärnan än vad fusion vid plasmamembranet skulle tillåta. De pH-känsliga konformationsförskjutningar som BV-fusionsproteinerna upplever tjänar till att utlösa en fusionshändelse mellan virushöljet och det endosomala membranet.
AcMNPV-nukleokapsids flykt från endosomen följs omedelbart av dess förening med F-actinkablar. Kabelbildningen är övergående och sker under den tid som virala nukleokapsider rör sig till och går in i kärnan. Under transiteringen samlokaliseras virala nukleokapsider med den ena änden av en aktinkabel, möjligen via P78/83, ett F-aktinbindande protein som tros finnas vid basen av nukleokapsiderna. Att nukleokapsiderna associeras med F-actinkablar och att reportergenuttrycket fördröjs i närvaro av läkemedel som stör aktin/myosin-funktionen tyder på att kablarna kan underlätta transporten av nukleokapsiderna till kärnan eller förmedla deras passage genom kärnporer.
NPV och vissa GV-nukleokapsider går in i kärnor via kärnporer. Vissa GVs avmantlar sig vid kärnporerna, men den mesta av avmantlingen av baculovirus sker inom kärnan. Den tidiga gentranskriptionen börjar omedelbart och förmedlas av värdets RNA-polymeras II (Pol II). Bland de tidiga gener som uttrycks finns en delmängd vars uttryck leder till effektiv transport av G-aktin till och ackumulering i kärnan (figur 5). Denna spektakulära manipulation av aktinlokaliseringen är avgörande för NPV:s produktion av avkomma och har inte beskrivits för någon annan patogen. De gener som är involverade i aktinets nukleära lokalisering och som identifierades i transienta transfektionsexperiment är ie1, pe38, Ac004, Ac152, he65 och Ac102. Två av generna, ie1 och Ac102, är bevarade bland alla lepidoptera NPV och GV och båda är essentiella.
Figur 5. Nuclear G-actin i AcMNPV-infekterade celler. (a) 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-färgade infekterade celler; (b) infekterad cell som uttrycker transfekterat grönt fluorescerande protein (GFP)-actin. (c) Avsaknad av nukleär rhodamin-falloidinfärgning indikerar att det nukleära aktinet är monomeriskt.
Övergången till det sena infektionsstadiet är början på perioden för produktion av BV-avkommor; de cellulära aktiviteterna är inriktade på att syntetisera virala komponenter i maximal takt, sätta ihop dem till nukleokapsidprodukter och sedan exportera dem. Värdens makromolekylära syntes stängs av under denna period, men värdens kromatinstruktur förblir intakt fram till celldöd. Sena och mycket sena virusgener uttrycks av ett RNA-polymeras som kodas av viruset.
Mikrotubuli, som omorganiserats under infektionens tidiga fas, depolymeriseras av faktorer som produceras under den sena fasen, vilket leder till att cellen rundas av (figur 6). På samma sätt polymeriseras G-actin, som ackumuleras i kärnan under den tidiga fasen, under den sena fasen, samtidigt som kärnan sväller och de synliga kärnstrukturerna försvinner (figur 7). Det virogena stroma, platsen för den virala DNA-syntesen, bildas i mitten av kärnan och är genomsyrat och omgivet av en elektronlysande zon som kallas ”ringzonen”, en plats där kapsiderna monteras ihop och fästs under laddningen av genomet. Nuclear F-actin co-localizes with the major AcMNPV capsid protein in the ring zone (Figur 7).
Figure 6. AcMNPV-infekterade Sf21-celler som uppvisar olika faser av cytopatisk effekt (CPE). (a) Oinfekterade celler. Observera spindelform och förekomst av nukleokromatinstrukturer. (b) AcMNPV-infekterade celler som visar tidig och sen CPE. Cellerna är rundade på grund av depolymeriserande mikrotubuli, kärnorna är större och rensade från värdstrukturer, och virogent stroma (vs) är omgivet av ringzon (rz). Virogena stroma blir tätare när det sena skedet av infektionen fortskrider. Polyhedra fyller kärnan under det mycket sena infektionsstadiet (p).
Figur 7. Nuclear F-actin i AcMNPV-infekterad cell under sent genuttryck. (a) DAPI-färgning visar kärnans placering. (b) Grön fluorescens indikerar att kapsidprotein främst är lokaliserat i kärnans ringzon. (c) Rhodamin-falloidinfärgning visar att F-actin samlokaliseras med capsid i ringzonen.
Kärnans F-actin krävs för BV-produktion. I närvaro av F-actinstörande läkemedel är viruskapsiderna missbildade och uppträder som långa tubulära strukturer intill det inre kärnmembranet med sällsynta fläckar av elektrontätt material. Basplattor och kapselstrukturer som normalt är närvarande är inte uppenbara, och ett överskott av membranösa profiler produceras. Den virala DNA-syntesen sker i normal takt, men genomerna är inte paketerade, och det virogena stroma har ett ”avslappnat” utseende jämfört med normalt stroma. Intressant nog är fenotypen för avsaknad av AcMNPV very late factor-1 (VLF-1) likartad, vilket tyder på att VLF-1 kan vara involverad i att binda kapsiderna till det virogena stroma, och att F-actin är en komponent i stroma till vilken kapsiderna är fästade, direkt eller indirekt.
P78/83, ett mindre kapsidprotein som uttrycks sent under infektionen, är väsentligt för AcMNPV:s livskraft. Denna egenskap noterades för över 30 år sedan och utnyttjades i de första kommersiella expressionsutrustningarna för baculovirus. P78/83 (78 kDa när det är ofosforylerat och 83 kDa när det är fosforylerat) tros vara en del av basplattorna i både BV- och ODV-kapsiderna. P78/83 är ett F-aktinbindande protein, och denna aktivitet kan bidra till att binda kapsidorna till kärnmatrisen under sammansättningen. Intressant nog innehåller P78/83 en annan aktivitet som förklarar varför det är viktigt; det främjar aktinpolymerisation i kärnan. P78/83 innehåller domäner som är bevarade i medlemmar av Wiskott-Aldrichs syndromproteinfamiljen (WASP), faktorer som främjar kärnbildning av aktinfilament. Medlemmarna i WASP-familjen reglerar positivt den aktin-nukleerande aktiviteten hos Actin Related Protein (Arp)-2/3-komplexet. Komplexet med sju underenheter, som bevaras i alla eukaryoter, translokeras till kärnan i AcMNPV-infekterade celler och aktiveras av P78/83. Mutationer i P78/83 som leder till minskad förmåga att främja aktinnukleering leder på motsvarande sätt till minskad förmåga att producera infektiös BV.
Omedelbart efter inträdet i kärnan antar AcMNPV-dna en nukleosomalliknande struktur och använder nukleosomer och nukleosomrelaterade processer vid genomreplikation. En komponent i virusets replikationsstrategi tycks därför vara att kapa komponenter av, om inte hela, värdkromatinets remodelleringskapacitet. Nya bevis tyder på att BRO-familjen (baculovirus repeated orf) av proteiner sannolikt deltar i denna process. BRO-proteinerna uttrycks tidigt under infektionen, binder enkelsträngat DNA (ssDNA) och kärnhistoner och delar sig med histoner i fraktioneringsexperiment. BmNPV, orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus och lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus har alla flera bro-gener. AcMNPV bär endast på en bro-gen, besläktad med BmNPV bro-d, som är essentiell.
AcMNPV-kodade P6.9, det mycket basiska genomförpackningsproteinet, börjar ackumuleras under det sena skedet av infektionen och en alternativ kromatinstruktur uppstår.
P6.9-DNA-interaktionerna styrs av fosforyleringstillståndet hos P6.9. Under genomförpackningen binder det genomiska DNA:t från det virogena stroma till P6.9 när P6.9 avfosforyleras och kondenserar till en förformad kapsidskida genom en öppning i en konisk ändstruktur. De koniska strukturerna ligger proximalt i förhållande till det virogena stroma och kapsidskedena är täckta av basplattor som sträcker sig distalt in i ett mindre elektrontätt utrymme, ringzonen. F-actin och kapsidprotein samlokaliseras i ringzonen tillsammans med P78/83 och Arp2/3-komplexet. Det är detta replikationsstadium som påverkas både av läkemedel som stör F-actin och frånvaro av VLF-1.
Med början av den mycket sena infektionsfasen minskar BV-produktionen och ODV-produktionen börjar. Nyligen sammansatta nukleokapsider stannar kvar i kärnan där de är insvepta i höljen som tros härröra från det inre kärnmembranet. Inhöljda virioner, men inte oinhöljda nukleokapsider, blir inkapslade i en proteinmatris för att bilda kapslar eller polyeder. Cellerna lyserar så småningom och släpper ut ocklusionerna i mediet.