Differentiering mellan vildsvin och tamgris i livsmedel genom att rikta in sig på två genloci med realtids-PCR

Design av primers och sonder

För design av primers och sonder valde vi polymorfismer som redan rapporterats för att göra det möjligt att skilja mellan vildsvin och tamgris. Vi började med SNP:n g.299084751 C > T i NR6A1-genen, som har visat sig vara förknippad med antalet bröst- och ländkotorvlar: vildsvin, som är homozygota för vildtypsallelen g.299084751 C, har 19 kotorvlar, medan tamsvin, som är homozygota för g.299084751 T, har 21-23 kotorvlar. I studien av Fontanesi et al. användes denna SNP för att särskilja vildsvin och tamsvin genom PCR-RFLP10. Vårt mål var att utforma ett primerpar för amplifiering av målregionen hos både vildsvin och tamgris och två TaqMan-sonder som är specifika för vildsvinsallelen (g.299084751 C) respektive allelen hos tamgris (g.299084751 T). Duplexanalysen bör göra det möjligt att påvisa vildsvin och tamsvin samtidigt i en och samma brunn. Totalt utformade vi fyra framåtriktade primers, tre bakåtriktade primers, fyra vildsvinssonder och en sond för tamgrisar och kombinerade dem till 21 primer/sondersystem (Chr1a – u, kompletterande tabell 1). Primer/provsystemet Chr1a var inriktat på den övre strängen och primer/provsystemen Chr1b-u på den nedre strängen av NR6A1-genen. I en serie experiment undersökte vi om primer/provsystemen var specifika för vildsvin eller om de uppvisade korsreaktivitet med tamgrisraser/korsningar. Primer/sondsystem Chr1a resulterade i ett ΔCt-värde ≥ 10,56 mellan tamgris och vildsvin (kompletterande tabell 2). För primer/provsystem Chr1i – o varierade ΔCt-värdena mellan 8,65 och 11,19. Primer/provsystem Chr1b – h och Chr1p – t resulterade inte i någon ökning av fluorescenssignalen för tamgrisraser/ korsningar. Eftersom primer/provsystem Chr1q resulterade i det lägsta Ct-värdet (24,77; n = 2) för vildsvin testade vi dess tillämplighet i kombination med en TaqMan-sond för tamgris i duplexanalysformat (primer/provsystem Chr1u, kompletterande tabell 1). Eftersom Ct-värdena för både vildsvin (26,21, n = 2) och tamgris (27,90, n = 2) var tillfredsställande utfördes alla ytterligare PCR-experiment med inriktning på SNP g.299084751 C > T med primer/provsystem Chr1u. I det följande kallas duplex-PCR-testet i realtid för assayChr1, som består av testet för tamgris, assayChr1D, med forwardprimer Chr1f4, reverse primer Chr1r2 och sond Chr1p1D, och testet för vildsvin, assayChr1W, med forwardprimer Chr1f4, reverse primer Chr1r2 och sond Chr1p4W (Fig. 1A).

Delsekvenser av (A) NR6A1-genen på kromosom 1 som bär SNP g.299084751 C > T, som är föremål för duplexanalysen ”assayChr1”, och (B) kromosom 9 med SNP g.118314929 A > G (rs81416363), som är föremål för de två singleplexanalyserna ”assayChr9D” och ”assayChr9W”. Pilarna anger positionerna för primers (mörkgrått) och prober (ljusgrått). (A) DuplexassayChr1 innehöll forwardprimer Chr1f4, reverseprimer Chr1r2, probe Chr1p4W och probe Chr1p1D. (B) SingleplexanalysChr9D innefattar forwardprimer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D och probe Chr9p2; singleplexanalysChr9W innefattar forwardprimer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W och probe Chr9p2. Underartsspecifika baser visas i fetstil (vertikala röda pilar) och felmatchade baser i blått (vertikala blå pilar).

Med tanke på att vi hade lärt oss av litteraturen att diskrimineringsförmågan genom att rikta in sig på endast en polymorfism troligen inte är tillräcklig, letade vi efter ytterligare en lämplig genlokus. Genom att undersöka 20 SNP:er för deras tillämplighet för att skilja mellan vildsvin och tamsvin hade Beugin et al. funnit att SNP:erna rs80864596 (intergen, kromosom 5), rs80796712 (glykogensyntaskinas 3-beta, kromosom 13) och rs81416363 (intergen, kromosom 9) uppvisade den högsta diskrimineringsförmågan11. Vi valde därför ut dessa tre SNP:er för att utforma primer/provsystem. Jämfört med utformningen av primer/sonder för SNP g.299084751 C > T följde vi en annan strategi. I stället för att placera den underartsspecifika basen i sonden placerade vi den på den näst sista platsen från 5′-änden av den framåtriktade eller omvända primern. För att öka specificiteten införde vi avsiktliga basmissmatchningar. Denna så kallade MAMA-teknik (mismatch amplification mutation assay)12,13 har den fördelen att den är ganska kostnadseffektiv eftersom en och samma sond kan testas med ett antal primers som skiljer sig åt i mismatchpositionen. I den första försöksserien införde vi mismatchbasen antingen i tredje eller sjätte positionen från 3′-änden av den primer som bär den underartsspecifika basen. När vi hade utvecklat realtids-PCR-analyser för kronhjort, dovhjort och sikahjort14,15,16 hade denna strategi visat sig vara framgångsrik. I den aktuella studien kunde dock inget av primerna/sondsystemen (Chr5b-d, Chr13b-c, Chr9b-g, Chr9i-n, kompletterande tabell 1) användas för att skilja mellan tamgris och vildsvin (kompletterande tabell 3). De bästa resultaten (ΔCt-värde mellan tamgrisraser/korsningar och vildsvin ≥5,24) erhölls med primer/sondsystem Chr9j. I detta primer/provsystem, som är inriktat på SNP rs81416363 på kromosom 9, var mismatchbasen placerad i den tredje positionen från primerns 3′-slut (TTCACG → TTCCCG). För att öka specificiteten införde vi ytterligare en mismatchning i den fjärde (TTCACG → TTGCCG, TTACCG, TTTCCG) eller femte positionen (TTCACG → TACCCG, TCCCCG, TGCCCG) från primerns 3′-ända. Införandet av ytterligare missmatchningar visade sig vara framgångsrikt. Med primer/sondsystem Chr9r (kompletterande tabell 1) fick vi både det lägsta Ct-värdet för vildsvin (22,09; n = 2) och det högsta ΔCt-värdet (10,52) mellan tamgrisraser/korsningar och vildsvin (kompletterande tabell 3). Denna realtids-PCR-analys för vildsvin, som är inriktad på SNP rs81416363 på kromosom 9, baserades på primer/sondsystem Chr9r (Chr9f8, Chr9r12W, Chr9p2).

Nästan tillämpade vi MAMA-strategin för att utveckla motsvarande realtids-PCR-analys, som är inriktad på SNP rs81416363 på kromosom 9, för tamgris. Vi lokaliserade den husgrisspecifika basen vid den näst sista basen från primerns 5′-ändan och mismatchbasen vid den tredje positionen från 3′-ändan (primer/provsystem Chr9v – x; kompletterande tabell 1). Införandet av en mismatchbas var dock inte tillräckligt för att möjliggöra differentiering av tamgris och vildsvin. Införandet av felmatchade baser i tredje och femte positionen från 3′-änden av primern (primer/provsystem Chr9y – ag) ledde till ett ΔCt-värde ≥ 4,83. När mismatchningarna fanns på positionerna 3 och 4 (primer/provsystem Chr9ah – aj) var ΔCt-värdet ≥5,85. Genom att införa tre på varandra följande baser för felmatchning bredvid den underartsspecifika basen (primer/provsystem Chr9ak – am) kunde specificiteten ökas. Primer/provsystem Chr9ak, där mismatchningarna fanns i position 3, 4 och 5 (TTCATG → TGGTTG) ledde till det högsta ΔCt-värdet på ≥9,97. Därför utfördes alla ytterligare experiment med primer/sondesystem Chr9ak. I det följande benämns de två singleplexanalyserna med inriktning på SNP rs81416363 på kromosom 9 som assayChr9D, inklusive forwardprimer Chr9f8, reverse primer Chr9r17D och probe Chr9p2, och assayChr9W, inklusive forwardprimer Chr9f8, reverse primer Chr9r12W och probe Chr9p2 (fig. 1B).

Optimering av primer/sondkoncentration och förhållandet

Alla resultat som presenteras ovan erhölls med primer- och sondkoncentrationer på 500 nM och 200 nM (primer/sondsystem riktade mot kromosom 1) respektive 200 nM och 100 nM (primer/sondsystem riktade mot kromosomerna 5, 9 och 13). Därefter undersökte vi om specificiteten hos realtids-PCR-analyserna kunde ökas genom att optimera koncentrationen och förhållandet mellan primer och sond. När det gäller assayChr1 visade sig de optimala koncentrationerna av primer och sond vara 1 000 nM respektive 200 nM (kompletterande tabell 4). När det gäller assayChr9W och assayChr9D resulterade ett överskott av primern med både den underartsspecifika basen och mismatchbaserna i högre ΔCt-värden mellan den korsreagerande underarten och målarten. Den högsta selektiviteten för assayChr9W och assayChr9D uppnåddes med koncentrationer av forward primer/reverse primer/probe på 12,5/200/50 nM respektive 62,5/800/50 nM.

Korsreaktivitetstester

Nästan utförde vi korsreaktivitetstester med DNA-isolat från vildsvin, olika tamgrisraser/korsningar av grisar och ytterligare 22 djurarter som förtecknas i kompletterande tabell 5. Figur 2A-D visar de amplifieringskurvor som erhållits med assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W respektive assayChr1D. AssayChr9W uppvisade en liten korsreaktivitet med tamsvin, sikahjort, alpin stenbock, får, get och gems (ΔCt ≥ 12,10, n = 2), assayChr9D med vildsvin, sikahjort, älg, häst och kalkon (ΔCt ≥ 8,41, n = 4). Till skillnad från de tester som är inriktade på SNP rs81416363 på kromosom 9 uppvisade assayChr1 ingen korsreaktivitet (med undantag för assayChr1W för rådjur i endast en av fyra replikat). Vi analyserade också DNA-isolat från 50 växtarter som vanligen används som livsmedelsingredienser (kompletterande tabell 6). Ingen av analyserna visade korsreaktivitet med någon av växtarterna.

Resultat som erhållits genom att utföra korsreaktivitetstester med DNA-isolat (10 ng/µL) från 22 djurarter och vildsvin/husgris. (A) assayChr9W, (B) assayChr9D, (C) assayChr1W och (D) assayChr1D.

Screening av olika kommersiella mastermixer för deras tillämplighet

I en nästa serie experiment undersökte vi om typen av kommersiell mastermix påverkade selektiviteten i testerna. Vi analyserade DNA-isolat från 23 djurarter, inklusive 3 vildsvinsindivider och 11 raser/korsningar av tamgris, med totalt fem mastermixer från olika leverantörer. Huvudblandningarna och respektive temperaturprogram anges i den kompletterande tabellen 7. I allmänhet påverkade typen av mastermix både de absoluta Ct-värdena och ΔCt-värdena mellan mål- och korsreagerande (sub)arter. Realtids-PCR-analyserna påverkades dock i olika utsträckning. När det gäller assayChr9W resulterade till exempel mix 2 och 3 i högre Ct-värden än master mix 1 (standardmaster mix i denna studie), 4 och 5 (Ct ± SD (n = 6): mix 1: 25,03 ± 0,15; mix 2: 31,17 ± 1,70; mix 3: 28,43 ± 0,13; mix 4: 26,64 ± 0,10; mix 5: 26,64 ± 0,17). När det gäller assayChr9D hade typen av mastermix en inverkan på ΔCt-värdena och därmed assayets selektivitet. De ΔCt-värden som erhölls med master mix 1, 2, 3 och 4 var ≥ 8,41, ≥ 10,40, ≥ 7,18 respektive ≥ 5,86, medan ingen korsreaktivitet alls observerades med master mix 5. När det gäller assayChr1 erhölls ganska liknande Ct-värden med mastermix 1, 3 och 4. Master mix 2 och 5 resulterade dock inte i att det bildades några produkter, vilket troligen beror på att dessa mixar inte är lämpliga för multiplexering. Baserat på dessa resultat rekommenderar vi starkt att man testar tillämpligheten om man avser att använda en annan typ av mastermix.

Robusthet

Robustheten hos realtids-PCR-analyserna undersöktes genom att man varierade glödgningstemperaturen ±1 °C och volymen reaktionsblandning per brunn med ±5 % och genom att använda två olika realtids-PCR-cyklers. Försöken utfördes med DNA-isolat från vildsvin, tamsvin och rådjur. För assayChr9W och assayChr9D var Ct-värdena mycket lika de som erhölls under standardförhållanden (ΔCt-värden <1,00) utom när glödgningstemperaturen ökades till 61 °C (ΔCt-värden ≤2,16 respektive ≤1,57). Med ΔCt-värden ≤0,77 visade sig assayChr1 vara ännu mer robust. Varken nedskalning av den totala reaktionsvolymen eller användning av en annan realtids-PCR-cycler påverkade Ct-värdena nämnvärt, vilket visar att realtids-PCR-analyserna är robusta.

Arbetsområde, linjärt område och amplifieringseffektivitet

Vid analys av ett vildsvins-DNA-isolat (211 µg/mL) och två DNA-isolat från tamgrisar (158 µg/mL och 160 µg/mL) som spätts ut seriellt i vatten (1:2-1:524,288) var assayChr9W, assayChr9D, assayChr1W och assayChr1D linjära mellan 211 µg/mL och 13 ng/mL (R2 = 0.9948), 158 µg/mL och 10 ng/mL (R2 = 0,9981), 211 µg/mL och 6 ng/mL (R2 = 0,9994) respektive 160 µg/mL och 10 ng/mL (R2 = 0,9988) (fig. 3A). Amplifikationseffektiviteten beräknad från standardkurvernas lutningar var 83 %, 96 %, 93 % respektive 95 %. Dessutom utvärderades linjäritetsområdet genom att analysera DNA-isolat från vildsvin och tamsvin som spätts ut i serie i DNA från sillspermier. För assayChr9W och assayChr9D varierade linjäriteten från 20 µg/mL till 20 ng/mL (R2 = 0,9988) respektive 20 µg/mL till 39 ng/mL (R2 = 0,9985) (fig. 3B). När det gäller assayChr1W och assayChr1D var linjäriteten inom intervallet från 20 µg/mL till 5 ng/mL (R2 = 0,9978) respektive 20 µg/mL till 10 ng/mL (R2 = 0,9988). Amplifikationseffektiviteten beräknad från standardkurvans lutning var 76 %, 90 %, 97 % respektive 101 %.

Linjäritetsintervall för de fyra testerna, (A) bestämd i vatten som bakgrund och (B) bestämd i DNA från sillspermier som bakgrunds-DNA som inte är måltavla.

Dessa resultat visar att arbetsområdet för realtids-PCR-analyserna är nästan identiskt, medan linjäritetsområdet är smalare för de analyser som är inriktade på kromosom 9 än för dem som är inriktade på kromosom 1. Alla amplifieringseffektiviteter låg mellan 90 % och 110 %, enligt rekommendationerna i ENGL:s riktlinjer17 , utom för assayChr9W (83 % i vatten, 76 % i DNA från sillspermier). Den lägre amplifieringseffektiviteten för assayChr9W orsakas troligen av minskad primerbindningsstabilitet på grund av mismatchningarna, som införts för att öka selektiviteten för måldjursarten.

Detektionsgräns (LOD) i sillspermier-DNA och gris-DNA som bakgrunds-DNA

Detektionsgränsen (LOD) definierades som den lägsta DNA-koncentrationen som resulterade i en ökning av fluorescenssignalen i minst 19 av 20 replikat. Dessutom bör Ct-värdet ligga under det Ct-värde som erhålls för korsreagerande arter.

I sillspermiernas DNA var LOD för assayChr9D (1,0 %, w/w, Fig. 4A) var något högre än LOD för de andra tre testerna (0,2 %, w/w, fig. 4B-D). Den högre LOD för assayChr9D orsakas av korsreaktiviteten med vildsvin (ΔCt-värde mellan vildsvin och tamgris endast ≥8,41).

Bestämning av LOD genom analys av serieutspädningar av (A-D) DNA-blandningar som innehåller vildsvins- eller tamgris-DNA i sillspermier-DNA och (E-H) en DNA-blandning som innehåller vildsvins-DNA i tamgris-DNA eller tamgris-DNA i vildsvins-DNA som bakgrunds-DNA. (A,E) erhölls genom att använda assayChr9D, (B,F) genom att använda assayChr9W, (C,G) genom att använda assayChr1D och (D,H) genom att använda assayChr1W. Mätningarna utfördes i 20 upprepningar. Cirklar representerar individuella Ct-värden, horisontella linjer anger medelvärden.

Därutöver bestämde vi LOD för realtids-PCR-analyserna för vildsvin, assayChr1W och assayChr9W, med DNA från tamgris som bakgrund, och för analyserna för tamgris, assayChr1D och assayChr9D, med vildsvins-DNA som bakgrund. Med 2 %, 0,2 %, 5 % och 2 % (w/w) var LOD för assayChr9D (fig. 4E), assayChr9W (fig. 4F), assayChr1D (fig. 4G) och assayChr1W (fig. 4H) ganska olika. Den högre LOD för assayChr1D i närvaro av vildsvins-DNA orsakades av signalundertryckning, troligen på grund av att de två proberna konkurrerar om målsekvensen i duplexanalysformatet. För att undersöka signalundertryckningen närmare analyserades DNA-blandningar som innehöll antingen 25 % (w/w) vildsvins-DNA i DNA från tamgris eller 25 % (w/w) DNA från tamgris i vildsvins-DNA, utöver positiva kontroller (vildsvins-DNA respektive DNA från tamgris).

När vi jämförde de positiva kontrollerna med de 1:4 utspädda standarderna som innehöll icke-mål-DNA fann vi ingen skillnad i amplifieringskurvorna (ΔRn-värden) för assayChr9W och assayChr9D (fig. 5A,B). När det gäller assayChr1W och assayChr1D var dock de fluorescenssignaler (ΔRn-värden) som erhölls för den positiva kontrollen högre än de som erhölls för den 1:4 utspädda standarden vid samma mål-DNA-koncentration (fig. 5C,D).

Amplifieringskurvor (i semi log-vy) som erhållits för DNA-blandningar (20 ng/µL) som innehåller 25 % (w/w) av målunderarten (vildsvin eller tamgris) och 75 % (w/w) av icke-målunderarten (vildsvin eller tamgris) och seriella utspädningar därav (1:4 till 1:1,024). DNA-isolat (5 ng/µL) från vildsvin respektive tamsvin användes som kontroller. AssayChr9W (A) och assayChr9D (B) uppvisar korsreaktivitet med underarter som inte är målarter. AssayChr1W (C) och assayChr1D (D) visar signalundertryckning i närvaro av underarter som inte är målarter.

Upprepningsbarhet

Upprepningsbarheten för realtids-PCR-analyserna undersöktes genom att analysera blandningar av köttextrakt som innehöll 30 % (vikt/vikt) DNA från målarten och 70 % (vikt/vikt) DNA från underarter som inte är målarter, samt serieutspädningar av dessa, i två exemplar fem gånger under fyra olika dagar. RSD för Ct-värdena var ≤1,0 % (assayChr1W), ≤1,9 % (assayChr9W), ≤2,3 % (assayChr1D) och ≤3,5 % (assayChr9D), vilket visar att testerna har hög repeterbarhet.

Analys av prover från vildsvin och tamgrisindivider

Den verkliga PCR-analysen i realtid tillämpades på analysen av prover från 64 tamgrisindivider, inklusive 14 raser och 6 korsningar av raser (fig. 6A). Dessutom analyserade vi totalt 30 vildsvinsprover från fem olika länder (Österrike, Estland, Tyskland, Rumänien och USA, fig. 6B). När det gäller en vildsvinsindivid från Europa var det exakta ursprunget okänt. Varje prov analyserades i minst fyra upprepningar. Till varje PCR-platta tillsattes en positiv kontroll (DNA-blandning, 10 ng/µL) som innehöll målunderarten i samma koncentration som LOD, vilket gav Ct-värdet.

Resultat som erhållits för (A) 64 prover från tamgrisar och (B) 30 prover från vildsvin. Mätningarna utfördes i minst fyra upprepningar.

När vi analyserade de positiva kontrollerna i 14 upprepningar var medelvärdet ± SD för Ct-värdena 33,85 ± 0,93 (assayChr9W), 35,19 ± 1,11 (assayChr9D), 32,89 ± 0,28 (assayChr1W) och 32,60 ± 0,47 (assayChr1D). Med undantag för assayChr9D ansågs alla prover som resulterade i högre Ct-värden vara <LOD. När det gäller assayChr9D erhölls Ct-värden ≥ 34,61 för flera vildsvinsprover. För att minska sannolikheten för falskt positiva resultat fastställde vi cut-off Ct-värdet för assayChr9D till 34,00. För tillämpningen av assayChr9W och assayChr9D i rutinanalyser rekommenderar vi att man använder en positiv kontroll bestående av 2 % (w/w) DNA från tamsvin, 0,2 % (w/w) DNA från vildsvin och 97,8 % (w/w) DNA från sillspermier.

För analysen av prover från tamsvin med assayChr9D erhölls 63 positiva och endast ett negativt resultat (Mangalica 1) (fig. 6). Från de 12 Cinta Senese-individerna analyserade vi två olika köttdelar, ett magert prov (från longissimus dorsi) och ett subkutant ryggfettsprov (från länsbenet) (data visas inte). De Ct-värden som erhölls för magra prover (genomsnittlig Ct ± SD på 25,24 ± 0,44, n = 48) var mycket lika de för subkutana ryggfettsprover (26,29 ± 0,35, n = 48). När vi analyserade de 30 vildsvinsproverna med assayChr9D resulterade 21 inte i någon ökning av fluorescenssignalen, men nio individer (en från Österrike, fem från Tyskland och tre från USA) identifierades som tamgrisar.

Med assayChr9W tilldelades majoriteten av vildsvinsproverna korrekt, endast för tre prover (ett från Tyskland och två från USA) fick vi negativa resultat. AssayChr9W ledde dock även till positiva resultat för några individer av tamgrisar, däribland en Bentheim Black Pied, tre Krškopolje- och tre Mangalica-svin. Framför allt identifierades de tre Mangalica-svinen från Österrike som tamgrisar, medan de tre individerna från Tyskland identifierades som vildsvin. När det gäller assayChr9, inklusive assayChr9W och assayChr9D, ledde 12 av de 94 köttproverna till tvetydiga resultat, eftersom en ökning av fluorescenssignalen uppnåddes med båda realtids-PCR-analyserna. Dessutom identifierades en Mangalica-grisindivid som vildsvin och tre vildsvinsindivider som tamgrisar.

I studien av Beugin et al.11 hade SNP rs81416363:s lämplighet testats på ”rena” vildsvin som jagades i en naturpark i Vosges i Frankrike och på ett begränsat antal kommersiella grisraser (Landrace, Large White, Piétrain och Duroc). Vildsvin visade sig bära G-allelen (frekvens 100 %, ingen heterozygositet), tamsvin A-allelen (frekvens 98 %, heterozygositet 5 %).

För att ta reda på varför assayChr9W och assayChr9D ledde till flera felklassificeringar och en del tvetydiga resultat genotypade vi de respektive proverna av vildsvin och tamsvin med hjälp av högupplösande smältningsanalys (HRM). Vi tillämpade HRM-analys eftersom det är en kraftfull, tids- och kostnadseffektiv teknik för SNP-genotypning18. De normaliserade smältkurvorna (fig. 7A) visar att den homozygota G-genotypen inte bara hittades för vildsvinsproverna, utan även för Mangalica-provet (prov 1) för vilket en ökning av fluorescenssignalen erhölls med assayChr9W men inte med assayChr9D. Vildsvinsprover som resulterade i en ökning av fluorescenssignalen med assayChr9D visade sig bära minst en kopia av A-allelen. Fyra vildsvinsindivider uppvisade heterozygot genotyp, fem var homozygota för A-allelen. Dessutom konstaterades fem individer av tamgrisar, inklusive tre Krškopolje-individer från Slovenien, vara bärare av både A och G-allelen. Genom HRM-genotypning kunde vi således kontrollera att de resultat som erhållits med assayChr9W och assayChr9D överensstämde med individernas respektive genotyper. Våra resultat visar dock att de två singleplex-testerna för SNP rs81416363, assayChr9W och assayChr9D, inte gör det möjligt att entydigt särskilja vildsvin och tamsvin.

Normaliserade HRM-kurvor för (A) SNP rs81614363 (g.118314929 A > G) på kromosom 9 för homozygot G (vildsvin), homozygot A (tamsvin) och heterozygot A + G och (B) SNP g.299084751 C > T på kromosom 1 för homozygot C (vildsvin), homozygot T (tamsvin) och heterozygot C + T.

Med assayChr1D klassificerades alla prover från tamsvin utom tre som tamsvin (fig. 6). I enlighet med assayChr9D var Ct-värdena som erhölls för magra och subkutana ryggfettsprov från de 12 Cinta Senese-individerna mycket likartade (genomsnittlig Ct ± SD på 25,99 ± 0,25 (n = 48) respektive 26,36 ± 0,25 (n = 48)). Med assayChr1D identifierades dock även fem av de 30 proverna från vildsvin som tamgrisar. Analysen av vildsvinsprover med assayChr1W gav endast ett negativt resultat. Men även ett prov från Mangalica och sex individer från Turopolje ledde till en ökning av fluorescenssignalen med assayChr1W.

I studien av Fontanesi et al.10 ledde SNP:en g.299084751 C > T genotypats genom analys av prover från 293 tamsvin av fem kommersiella raser (italiensk Large White, italiensk Landrace, italiensk Duroc, belgisk Landrace och Piétrain) och 201 vildsvin från södra Centraleuropa (norra Italien) och sydöstra Europa (Slovenien och västra Balkan). Fontanesi et al. fann att alla individer av tamgrisar var homozygota för T-allelen. 7,5 % av vildsvinsindividerna bar på minst en kopia av T-allelen, med individer från sydöstra Europa oftare (12,2 %) än individer från södra Centraleuropa (3,6 %). 11,1 % av vildsvinen från sydöstra Europa hade den heterozygota C/T-genotypen.

När vi genotypade vildsvins- och tamgrisindividerna för SNP g.299084751 C > T med hjälp av HRM-analys, upptäckte vi också T-allelen, inte bara hos tamsvin utan också hos vissa vildsvin (fig. 7B). Vildsvinsindividen från USA uppvisade homozygot T-genotyp medan vildsvinsindividen från Niederösterreich bar både C och T-allelen. Majoriteten av vildsvinsindividerna var dock homozygota för C-allelen. Detta resultat visar att ökningen av fluorescenssignalen för tre vildsvinsprov (Tyskland Bad Kissingen och Perleberg samt Europa) som erhållits med assayChr1D inte överensstämde med deras genotyp och därför orsakades av korsreaktivitet. Majoriteten av individerna av tamgrisar visade sig vara homozygota för T-allelen. Sex av åtta individer från Turopolje visade sig dock uppvisa den heterozygota genotypen C/T, vilket förklarar varför en ökning av fluorescenssignalen erhölls med både assayChr1D och assayChr1W. Den höga frekvensen av den heterozygota C/T-genotypen hos Turopolje, en tamgrisras från Kroatien, stämmer överens med en mycket färsk artikel från Fontanesis forskargrupp. Genom genotypning av 47 individer från Turopolje rapporterades frekvensen av T- och C-allelen vara 0,57 respektive 0,4319.

Våra resultat visar att varken de två singleplex-analyserna som är inriktade på SNP rs81416363 eller duplexanalysen som är inriktad på SNP g.299084751 C > T ensamma gör det möjligt att otvetydigt särskilja vildsvin och tamsvin. Genom att ta hänsyn till resultaten av de två singleplexanalyserna och duplexanalysen kan dock diskrimineringsförmågan ökas drastiskt. Våra resultat visar att om de två testerna för samma underart (t.ex. assayChr9D och assayChr1D) leder till en identisk klassificering (i det givna exemplet tamsvin), och om de resultat som erhålls med de två testerna för de andra underarterna (i det givna exemplet assayChr9W och assayChr1W) är tvetydiga, så är sannolikheten för felaktig klassificering låg om man förlitar sig på de resultat som är identiska. Med denna strategi kunde 86 (91,5 %) av 94 individer klassificeras korrekt.